Per iniziare, usando una pipetta, individua cinque microlitri di ciascun estratto a due centimetri di distanza sui punti contrassegnati sulla linea inferiore della piastra per cromatografia su strato sottile, o TLC. Lasciare asciugare le macchie sulla piastra TLC e ripetere fino a quando circa cinque milligrammi di ciascun estratto sono caricati sulla piastra. Preparare una soluzione 1:2 di diclorometano e metanolo in un serbatoio di sviluppo TLC.
Mettere la piastra TLC nel serbatoio di sviluppo e svilupparla, fino a quando il solvente raggiunge la linea segnata a due centimetri dalla parte superiore della piastra. Una volta sviluppata, rimuovere la piastra TLC dal serbatoio. Immediatamente, individuare i controlli positivi sui punti sopra la linea del solvente.
Posizionare la piastra in una scatola di piastre TLC sterilizzata con etanolo prima che tutto il solvente evapori. Raschiare il tappetino miceliale delle cinque placche patogene usando una spatola metallica sterile. Quindi, trasferiscilo in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.
Dopo aver aggiunto 25 millilitri di brodo di destrosio di patate modificato con agar, aggiungere perle di vetro sterili al tubo e agitare per cinque minuti per rompere il tappetino miceliale. Dopo aver montato lo spruzzatore per cromatografia nella cappa, collegare il tubo. Quindi, collegare il flussometro alla configurazione.
Trasferire la sospensione miceliale nello spruzzatore per cromatografia utilizzando una siringa sterile con la punta dell'ago per garantire che grossi pezzi di micelio non ostruiscano lo spruzzatore. Posizionare le piastre TLC sviluppate in precedenza su salviette di carta sterili nella cappa a flusso laminare per ridurre il contatto delle mani con la piastra, durante l'applicazione della sospensione del terreno. Collegare il campione di agente patogeno allo spruzzatore assemblato e applicare tre strati di sospensione sulla piastra TLC, lasciando che la piastra si asciughi completamente tra un'applicazione e l'altra.
Successivamente, prepara la configurazione di incubazione aggiungendo 50 millilitri di acqua sterile in una scatola di plastica sterilizzata. Posiziona quattro piastre di Petri su cui appoggiare la piastra TLC. Inoltre, posiziona fogli di cellulosa piegati sterilizzati o carta da filtro su ciascun lato della scatola per trattenere l'umidità.
Posizionare la piastra di analisi completata su quattro piastre di Petri vuote nella scatola. Incubare il test per tre giorni o una settimana o fino a quando uno strato uniforme di miceli cresce sulla piastra, ad eccezione dei controlli positivi e della zona di inibizione. Quindi, usando un cucchiaio di metallo, raschiare la silice dalle zone di inibizione e metterla in provette da microcentrifuga.
Aggiungere 500 microlitri di metanolo a ciascun tubo e vortice per estrarre i metaboliti dalla silice. Centrifugare le provette per pellettare la silice e trasferire il surnatante in fiale per cromatografia liquida per l'analisi. L'imaging sotto luce ultravioletta ha mostrato la separazione dei metaboliti sulla piastra TLC.
Dopo l'incubazione, l'agente patogeno sembrava crescere uniformemente su tutta la piastra, tranne che sui controlli positivi e sulle zone di inibizione.
