Immunocitochimica degli sferoidi delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) in una matrice di collagene 3D per lo studio dell'angiogenesi in vitro

Per iniziare, fissare i gel HUVEC sferoidi germogliati in un millilitro di paraformaldeide al 4% per un'ora. Lavare delicatamente i gel in un millilitro di PBS circa tre o quattro volte. Staccare completamente i gel dalla superficie di ciascun pozzetto della piastra, quindi trasferirli in nuove piastre da 24 pozzetti.

Aggiungere un millilitro di soluzione bloccante alla piastra a pozzetti, quindi incubare su un agitatore orbitale per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, pipettare 500 microlitri della soluzione di anticorpi primari nei pozzetti prima dell'incubazione. Il giorno successivo, lavare delicatamente i gel con PBS per cinque cicli di lavaggio di cinque minuti ciascuno.

Aggiungere 500 microlitri del corrispondente anticorpo secondario diluito con falloidina-FITC nel tampone bloccante. Incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius su un agitatore orbitale. Dopo aver lavato i gel in PBS, trasferirli su vetrini da microscopio.

Aggiungere due gocce di mezzo di montaggio contenente DAPI su un vetrino coprioggetti e posizionarlo su ogni gel. Sigillare i gel essiccati con lo smalto. Mettili al buio prima di riporli a quattro gradi Celsius fino a ulteriori analisi.