Per iniziare, preparare una soluzione di rivestimento contenente fattore di crescita ridotto della matrice della membrana basale e terreno di coltura degli organoidi in un rapporto di uno a due. Aggiungere 115 microlitri di soluzione di rivestimento a ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti in un'incubatrice umidificata. Per il metodo del collagene, aggiungere un millilitro di gel di collagene a un inserto della membrana interna da 30 millimetri e lasciarlo solidificare per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata.
Per raccogliere la miscela cellulare, lavare il tessuto di melanoma appena resecato in una piastra di Petri da 10 millilitri contenente terreno di lavaggio che viene posta sul ghiaccio. Usando una pinzetta sterile, trasferisci il tumore in un secondo piatto con un mezzo di lavaggio per il successivo lavaggio con ghiaccio. Durante i tre cicli di risciacquo utilizzando forbici sterili e una lama, rimuovere il tessuto connettivo in eccesso, il grasso e il sangue residuo.
Mettere il tumore in una capsula di Petri vuota e tritarlo finemente con lame sterili. Quindi trasferire il tessuto macinato in una provetta conica da 50 millilitri contenente 10 millilitri del mezzo di digestione preparato. Mettere il conico a bagnomaria a 37 gradi Celsius e vorticare ogni cinque minuti.
Dopo 25 minuti, aggiungere 30 millilitri di terreno ADMEM/F12 contenente il 10% di FBS per fermare la digestione. Quindi, filtrare la sospensione cellulare digerita attraverso un filtro cellulare in nylon da 70 micrometri e sciacquare il filtro con ADMEM/F12 integrato. Utilizzando una pipetta, recuperare il terreno rimanente sul fondo del filtro.
Quindi pellettare le celle a 300 x g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet nel terreno di coltura dell'organoide. Per la coltivazione, seminare 200.000 cellule nei pozzetti rivestiti di matrigel prebellico integrati con 200 microlitri di terreno di coltura di organoidi.
In alternativa, seminare 1 milione di cellule mescolate con un millilitro di gel di collagene sull'inserto della membrana in gel di collagene pre-solidificato posto in una piastra a sei pozzetti e aggiungere il terreno di coltura dell'organoide al pozzetto. Per il passaggio di organoidi da 150 a 200 micrometri, trasferirli in un conico da 15 millilitri e lavarli con il PBS di Dulbecco. Centrifugare la miscela a 300 x g per sette minuti a quattro gradi centigradi.
Dopo aver rimosso il surnatante, incubare gli organoidi con il sostituto della tripsina e mescolare ogni tre minuti. Per fermare la digestione, aggiungere ADMEM/F12 con terreno sierico ridotto contenente il 10% di FBS. Centrifugare la miscela a 300 x g per sette minuti e risospendere il palato nel terreno di coltura dell'organoide.
Infine, seminare la sospensione a singola cellula in un nuovo matrigel o in un pozzetto rivestito di collagene alla stessa densità di semina iniziale per l'incubazione. Le immagini al microscopio degli organoidi in tarda matrigel il secondo e il settimo giorno hanno indicato che le dimensioni degli organoidi aumentavano gradualmente. Inoltre, non c'era alcuna distinzione statisticamente significativa nella proporzione di cellule alfa-beta-T tra i tumori parentali e i rispettivi organoidi coltivati in matrigel o collagene.
