Per iniziare, capovolgere delicatamente le provette di sangue intero da 10 millilitri 10 volte a temperatura ambiente. Utilizzando un rotore a secchiello oscillante, centrifugare le provette a 800 g per 10 minuti a 22 gradi Celsius con il freno inserito. Quindi posizionare i campioni in una cabina di sicurezza biologica e verificare la presenza di tre strati distinti.
Etichettare tre provette di polistirene da cinque millilitri con le lettere A, B e C.Swirl e raccogliere un millilitro di buffy coat per aspirazione e trasferirlo nella provetta etichettata come A.Quindi aggiungere 60 microlitri di EDTA molare 0,1 alla provetta A contenente il buffy coat. Aggiungere 50 microlitri di miscela per cocktail alla provetta A.Pipettare su e giù almeno tre volte per mescolarla e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 890 microlitri di PBS alla provetta A e miscelare pipettando almeno tre volte.
Quindi, fai vorticare il tubo di perline magnetiche per 30 secondi. Aggiungere 50 microlitri di microsfere magnetiche alla provetta A e pipettare almeno tre volte per mescolare accuratamente le microsfere. Posizionare immediatamente la provetta A nel supporto magnetico e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita nella provetta B, raccogliendo la frazione chiara con globuli rossi assenti o minimi per un recupero ottimale della PBMC. Successivamente, rimuovere il tubo A dal supporto magnetico e smaltirlo. Quindi, aggiungere 50 microlitri di microsfere magnetiche alla sospensione cellulare nella provetta B e pipettare su e giù almeno tre volte.
Posizionare immediatamente la provetta B nel supporto magnetico e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita nella provetta C, raccogliendo solo la frazione chiara. Rimuovere il tubo B dal supporto magnetico e smaltirlo.
Quindi posizionare immediatamente la provetta C nel supporto magnetico e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita in una provetta da centrifuga etichettata e rabboccare fino a due millilitri con PBS. Trasferire 50 microlitri della sospensione cellulare in una tazza per campioni del contatore di cellule automatizzato.
Aggiungere 450 microlitri di PBS per una conta cellulare da 1 a 10 diluizioni.
