Per iniziare, ottieni la microglia umana dalle cellule staminali embrionali umane e raccoglile il giorno 56. Per la derivazione di organoidi retinici, coltivare le cellule staminali embrionali umane in un terreno di coltura fino a quando la densità cellulare raggiunge l'80-90%Aggiungere un millilitro di dispasi per pozzetto alle cellule di coltura e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver rimosso la dispae, aggiungere un millilitro di mezzo D a ciascun pozzetto.
Tagliate le celle a pezzetti. Con una pipetta da 10 microlitri, raccogliere delicatamente tutti i pezzi di cellule e il terreno in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare la provetta a 200 x g per cinque minuti.
Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere delicatamente le cellule in 200 microlitri di matrice fredda. Spostare la provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri in un'incubatrice per 20 minuti. Dopo 20 minuti nell'incubatrice, la matrice si solidifica.
Preparare una piastra da 10 centimetri con 15 millilitri di D medio. Risospendere la matrice con D media e agitare delicatamente la piastra di Petri. Metti il piatto in un'incubatrice per cinque giorni. Il giorno 12, sostituire il terreno con tre millilitri di dispase.
Dopo cinque minuti, aspirare la dispasi e aggiungere 15 millilitri di E.Introdurre la microglia raccolta agli organoidi retinici digeriti il giorno 12. Il giorno 19, agitare delicatamente la piastra per aggregare gli organoidi al centro del piatto e sostituire il mezzo E con il medio F.Infine, trasferire gli organoidi con il medio F in un nuovo piatto di sospensione. Al 30° giorno, gli organoidi retinici co-coltivati con microglia hanno mostrato una significativa autofluorescenza GFP, indicando la presenza di microglia.
Gli organoidi retinici co-coltivati hanno mostrato chiari segnali di immunofluorescenza per il marcatore fotorecettore CRX e il marcatore microgliale IBA1.
