Per iniziare, ottenere la sezione di tessuto endometriale umano su un vetrino per l'immunoistochimica multiplex e cuocere le sezioni di tessuto a 60 gradi Celsius per due ore. Successivamente, immergere il vetrino in sequenza in soluzioni appropriate per la deceratura, l'idratazione e il fissaggio. Aggiungere 200 millilitri del rispettivo tampone AR6 o AR9 per ciascun anticorpo a una cassetta di recupero dell'antigene resistente al calore.
Dopo aver posizionato le sezioni nel tampone di recupero dell'antigene, riscaldarle in un forno a microonde ad alta potenza fino all'ebollizione. Coprire la cassetta senza stringere e scaldare a bassa potenza per 15 minuti. Dopo che il vetrino si è raffreddato, sciacquarlo con acqua distillata doppia, seguita da PBST.
Quindi rimuovere la soluzione in eccesso con carta assorbente e disegnare un cerchio completo attorno al fazzoletto con una penna barriera idrofobica. Quindi incubare le sezioni con perossido di idrogeno al 3% per otto minuti a temperatura ambiente. Quindi, applicare una soluzione bloccante e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, applicare 150 microlitri del primo anticorpo primario, CD49a, su ciascun vetrino a una diluizione da 1 a 1000 in 1x diluente anticorpale. Prima di applicare l'anticorpo secondario, rimuovere l'umidità in eccesso utilizzando carta assorbente. Aggiungere da quattro a cinque gocce dell'anticorpo secondario 1x anti-topo e perossidasi di rafano di coniglio su ciascun vetrino.
Quindi diluire l'amplificazione del segnale della tiramide o il colorante TSA da 1 a 100 volte nel diluente di amplificazione. E aggiungere 150 microlitri di questa soluzione diluita a ciascun vetrino e incubare. Per eliminare i fluorofori non legati, far bollire le sezioni in 200 millilitri di tampone AR6 all'interno di una cassetta resistente al calore in un forno a microonde per due minuti.
Quindi accendi il microonde da alta potenza a bassa potenza per 15 minuti. Aggiungere 150 microlitri di soluzione di lavoro DAPI diluita in PBST goccia a goccia. Asciugare completamente le sezioni in una zona buia per circa 30 minuti.
Applicare una singola goccia di montante fluorescente anti-quenching e posizionare con cura un vetrino coprioggetti.
