Per iniziare, colorare le cellule murine del midollo osseo con Hoechst 33342. Per la citometria a flusso, avviare il software richiesto, quindi selezionare la standardizzazione QC. Inserire la provetta per il controllo qualità o il campione QC FluoroSphere nel portaprovette prima di selezionare start per iniziare la procedura di controllo qualità.
Per creare un nuovo esperimento, fare clic su Nuovo esperimento nel menu File e specificare il percorso del file e salvare l'esperimento. Quindi seleziona Imposta canale nel menu Impostazioni. Selezionare la casella di controllo del segnale del canale e aggiungere il nome del reagente nella colonna dell'etichetta.
Quindi, fare clic sull'icona pseudo grafici a colori nell'area del grafico per creare grafici. Fare clic su aggiungi provetta nella schermata delle provette per creare nuove provette campione e modificarne i nomi. Selezionare quindi Esegui per caricare il campione, visualizzare i grafici e stabilire i gate.
Regolare le impostazioni di guadagno e soglia e selezionare Registra per salvare i dati. Per progettare la logica di impostazione del gate, fare clic sull'asse x per selezionare FSEW e fare clic sull'asse y per selezionare FSEA. Selezionare Cancello poligonale per disegnare il cancello A per cerchiare la singola cella ed escludere le celle aderenti.
Per il secondo grafico, fare clic sull'asse x per selezionare FSEA e fare clic sull'asse y per selezionare SSEA. Seleziona Polygon Gate per disegnare il gate B per separare le celle non frammentarie ed escludere i detriti cellulari. Per il terzo grafico, fare clic sull'asse x per selezionare PIA e fare clic sull'asse y per selezionare SSEA.
Dopo aver disegnato il cancello B, selezionare le cellule vive che presentano ioduro di propidio negativo e disegnare il cancello C per ottenere cellule vive. Per il quarto grafico bidimensionale, fare clic sull'asse x per selezionare Hoechst Red, quindi fare clic sull'asse y per selezionare Hoechst Blue. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico e selezionare Proprietà dal menu a discesa.
Seleziona il formato lineare sia per l'asse x che per l'asse y e disegna il gate per le celle di popolazione laterali. Utilizzare contemporaneamente i laser a 355 nanometri e 405 nanometri per rilevare sia le celle di controllo che le celle sperimentali. Acquisizione di segnali fluorescenti ai canali 690 x 50 e 450 x 50 nanometri corrispondenti ai due laser.
Osservare l'efficace stimolazione del colorante Hoechst 33342 con laser a 355 e 405 nanometri per visualizzare le cellule della popolazione laterale chiara. Per gli stessi campioni, utilizzare i laser a 375 nanometri e 405 nanometri per il rilevamento cellulare. Il laser a 355 nanometri ha eccitato efficacemente il colorante Hoechst 33342, ottenendo una chiara osservazione delle cellule SP del midollo osseo.
Le cellule SP degli stessi campioni rilevati dal laser a 355 nanometri e dal laser a 405 nanometri sono risultate sostanzialmente identiche. Entrambi i laser a 375 nanometri e 405 nanometri hanno eccitato efficacemente Hoechst 33342 per ottenere celle SP.
