Per iniziare, prepara blocchi di cera da topi soppressi iniettati con pillole Xiaoyao. Tagliare i blocchi di cera in sezioni continue spesse sei micrometri e cuocere le fette a 70-72 gradi Celsius per 30-60 minuti. Trasferire le fette nella soluzione decerante per otto minuti, quindi disidratarle due volte in etanolo anidro al 75% per cinque minuti ciascuna prima di risciacquare in PBS per cinque minuti.
Ora eseguire la riparazione ad alta pressione EDTA per 15 minuti. Dopo aver risciacquato con PBS, aggiungere goccia a goccia il 3% di perossido di idrogeno al tessuto e incubare per 10 minuti. Lavare il fazzoletto tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna.
Usando una penna immunoistochimica, disegna un cerchio attorno al tessuto. Dopo aver lavato il tessuto con PBS, colorare per una notte in soluzione di anticorpi primari. Il giorno seguente, sciacquare il fazzoletto tre volte per cinque minuti ciascuna in PBS.
Aggiungere goccia a goccia l'anticorpo secondario e incubare per 60 minuti. Dopo il risciacquo con PBS, incubare il fazzoletto in una soluzione DAB pronta all'uso per tre-cinque minuti. Ora colora il tessuto con ematossilina per tre minuti.
Ancora una volta, sciacquare il fazzoletto con PBS prima di metterlo in soluzione di differenziazione per 10 secondi. Dopo il risciacquo PBS, aggiungere la soluzione di ritorno per 10 secondi. Infine, eseguire il trattamento con etanolo anidro al 75% per cinque minuti e sigillare il vetrino con resina neutra.
La colorazione con ematossilina-eosina ha mostrato trabecole strettamente disposte nei topi fittizi, mentre i topi OVX hanno mostrato alterazioni osteoporotiche tipiche con trabecole rade e cavità midollari allargate. Il confronto con la micro TC ha mostrato un reticolo trabecolare incompleto e un assottigliamento della corteccia ossea nei topi OVX rispetto ai topi fittizi. Dopo l'intervento farmacologico, la colorazione con ematossilina-eosina ha mostrato una struttura delle trabecole ripristinata e una ridotta cavità midollare rispetto al gruppo OVX.
Gli indici di imaging hanno mostrato un minor numero di trabecole fratturate e una reticolazione ripristinata nel gruppo delle pillole Xiaoyao ad alte dosi rispetto al gruppo OVX. I risultati dell'immunoistochimica hanno mostrato un aumento della fosfatasi alcalina e del collagene di tipo uno e una diminuzione dell'interleuchina 17, dell'ACT1 e dell'interleuchina 6 nel gruppo farmacologico.
