Per iniziare, rimuovere le provette da centrifuga da 1,5 millilitri contenenti 100 microlitri di argos solidificato all'1% dalla conservazione a quattro gradi Celsius. Mettere i tubi a bagnomaria a 42 gradi Celsius per sciogliere gli agros. Segnare le identificazioni dei campioni sull'estremità smerigliata dei due vetrini della cometa del pozzo.
Cellule tumorali U2 OS aderenti al seme in un piatto a sei pozzetti contenente DMEM e coltura per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, per dimostrare l'induzione della rottura dipendente dalla replicazione, trattare le cellule con un micromolare, Camptotecina o CPT per un'ora. Dopo il trattamento, aspirare il terreno e sciacquare le cellule due volte con PBS, aggiungere 300 microlitri di tripsina a ciascun pozzetto.
Incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per due o tre minuti. Ora aggiungi 700 microlitri di DMEM a ciascun pozzetto. Risospendere delicatamente e trasferire la sospensione in provette da centrifuga da 1,5 millilitri.
Centrifugare la sospensione cellulare a 2, 400 G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di PBS freddo. Dopo la centrifugazione finale, risospendere le cellule in un millilitro di PBS a una densità di due volte 10 alla potenza di cinque cellule per millilitro.
Trasferire 10 microlitri della sospensione cellulare in un'aliquota da 100 microlitri di argos fuso. Utilizzando la stessa punta della pipetta, mescolare delicatamente e distribuire uniformemente la miscela in un pozzetto del vetrino. Conservare i vetrini a quattro gradi Celsius al buio per 15-20 minuti.
Dopo la solidificazione, trasferire i vetrini in barattoli coplan contenenti tampone di lisi per un'ora, sciacquare i vetrini una volta con un tampone TAE freddo. Quindi immergere i vetrini in un tampone TAE freddo per 30 minuti. Versare circa 850 millilitri di tampone TAE freddo nell'apparecchio per elettroforesi.
Posizionare i vetrini sul vassoio per elettroforesi con l'orientamento corretto per consentire la migrazione del DNA rotto. Posizionare delicatamente il vassoio di scorrimento sopra il vassoio per coprire i vetrini. Collegare i cavi e impostare l'alimentazione a 21 volt.
Eseguire l'elettroforesi per 40 minuti. Dopo l'elettroforesi, rimuovere i vetrini e immergerli in una soluzione di precipitazione del DNA per 30 minuti. Trasferire i vetrini in una soluzione di etanolo al 70% per 30 minuti.
Asciugare i vetrini in un forno di ibridazione a 45 gradi Celsius per 30 minuti al buio. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione cyber green sui vetrini e incubare al buio. Dopo 30 minuti, inclinare il vetrino e rimuovere la soluzione colorante in eccesso tamponando delicatamente il bordo del pozzetto con un panno privo di lanugine.
Asciugare le diapositive in un cassetto per 30 minuti. Dopo aver acquisito le immagini per almeno 100 comete per campione, aprire il software di punteggio COMET ed esportare il punteggio delle immagini. Le comete che sono distinguibili individualmente e completamente contenute nel campo visivo.
L'induzione della rottura è aumentata significativamente nelle cellule OS U2 trattate con CPT e idrossiurea o HU rispetto ai controlli trattati con DMSO. La temperatura di lisi ha avuto un effetto minimo sulla migrazione della coda nelle cellule OS U2 non trattate. Il trattamento prolungato con HU nelle cellule OS U2 ha portato ad un aumento dell'induzione della rottura nel tempo.
L'aumento della concentrazione di CPT ha determinato un aumento dose-dipendente dell'accumulo di rotture nelle cellule OS U2. I livelli basali di rottura del DNA variavano tra le cellule OS hTERT-RPE-1, HEK293T e U2 con un aumento delle rotture osservato dopo il trattamento CPT. L'accumulo di rotture è stato osservato nelle cellule OS U2 trattate con HU, CPT e inibitore di PARP rispetto ai controlli DMSO.
