Per iniziare, incorporare la larva transgenica nell'agarosio a basso punto di fusione in una capsula a micropozzetti con fondo di vetro. Posizionare il piatto sul tavolino microscopico al microscopio invertito. Posizionare e mettere a fuoco la regione desiderata per l'ablazione al centro del campo visivo.
Scegli le impostazioni Z-stack per visualizzare l'intera larghezza dell'opercolo. Visualizzare l'area dell'opercolo di interesse prima dell'ablazione. Quindi, disegna una regione circolare con un diametro di 25 micrometri in un piano 2D selezionato.
Concentrati sull'opercolo utilizzando la regione di interesse, o strumento ROI. Per eseguire l'ablazione, applicare la potenza di ablazione misurata senza obiettivo a 450 milliwatt per una durata di 10 secondi. Esporre l'area selezionata al laser a due fotoni.
Dopo l'ablazione, confermare l'ablazione strutturalmente visualizzando lo stesso Z-stack con le stesse impostazioni utilizzate prima dell'ablazione. Usando una pinza o un ago da dissezione, rimuovere con cura le larve dall'agarosio a basso punto di fusione. Per prima cosa, rimuovi uno strato di agarosio che copre le larve.
In secondo luogo, rimuovere l'agarosio a diretto contatto con le larve. Rimettere le larve in un piatto con terreno E3 puro. A quattro o sei ore dalla lesione, ri-creare l'immagine dell'area opercolare utilizzando larve incorporate nell'agarosio con le stesse impostazioni sullo stesso microscopio.
Dopo aver elaborato le immagini nelle Fiji, quantificare le cellule con un'etichetta nucleare o misurando l'area, nel caso in cui le cellule si sovrappongano. Per quantificare l'area, creare una maschera che includa i macrofagi. Usa lo strumento Immagine, Regola, Soglia, Crea un ROI e analizza le particelle.
Quindi, misura l'area. Genera grafici che tracciano i risultati della misurazione utilizzando un software adatto. Un accumulo significativo di macrofagi nella regione opercolare ablata è stato rilevato sei ore dopo l'ablazione nelle larve post-fecondazione di sei giorni.
Nelle larve quattro giorni dopo la fecondazione, il numero di macrofagi aumentava a quattro ore dalla lesione. Il numero e l'area dei macrofagi sono aumentati a quattro ore dalla lesione rispetto allo stato non ablato.
