Per iniziare, posizionare i reagenti necessari per la preparazione dell'elettroforesi su gel su una piattaforma di lavoro. Aggiungere Tris/Borato/EDTA, o TBE, all'agarosio e scaldare la soluzione in un forno a microonde. Quindi, versare l'agarosio 0,4-0,5% in una teglia da colata per preparare un gel di agarosio di prima dimensione e lasciarlo solidificare per un'ora.
Dopo la solidificazione, caricare la scala entro i primi 3 centimetri rispetto al bordo più a sinistra del gel. Quindi caricare i campioni di DNA digeriti con enzimi di restrizione, garantendo una distanza di 3 centimetri tra ogni coppia. Far scorrere il gel in TBE per 19-24 ore a 0,85 volt per centimetro per separare gli intermedi in base alle dimensioni.
Il giorno seguente, rimuovere il gel dal tampone. Asportare i primi 3 centimetri del gel contenente la scala. Colorare il segmento di gel in TBE contenente 0,3 microgrammi per millilitro di bromuro di etidio per 10-15 minuti.
Quindi visualizza la scala utilizzando un sistema di documentazione su gel. Sul gel di agarosio, aggiungere 1,3 centimetri alla posizione stimata, ottenendo un valore di A.Quindi sottrarre 7,5 centimetri dal valore A, ottenendo il valore B.Allineare il righello contro il gel di prima dimensione e tagliare orizzontalmente ai valori A e B.Quindi tagliare verticalmente lo spazio di 3 centimetri riservato a ciascun campione. In un nuovo vassoio di colata, ruotare i segmenti in senso orario e posizionarli nella posizione dei pozzetti del campione.
Preparare il gel di agarosio di seconda dimensione ad una concentrazione dell'1-1,3% in TBE con 0,3 microgrammi per millilitro di bromuro di etidio. Riscaldare il gel e, dopo averlo raffreddato a circa 55 gradi Celsius, versarlo sui segmenti ruotati della prima dimensione. Lasciare solidificare il gel per un'ora.
Dopo la solidificazione, trasferire il gel in una camera contenente TBE a 0,3 microgrammi per millilitro di bromuro di etidio e lasciarlo equilibrare per 30 minuti. Coprire il gel e far funzionare per 9-10 ore a 4,23 volt per centimetro a 4 gradi Celsius. Rimuovere il gel di seconda dimensione dalla camera e depurinare i frammenti di DNA per 10 minuti in una soluzione di acido cloridrico 0,24 molare con un leggero oscillamento.
Sciacquare il gel con acqua deionizzata e immergerlo in idrossido di sodio molare 0,4 per 10-15 minuti. Quindi piegare due lunghi fogli di carta per cromatografia perpendicolarmente sulla lastra di vetro, estendendosi nel contenitore. Per assemblare il southern blot, riempire un contenitore con 1 litro di idrossido di sodio molare da 0,4 molari.
Allineare una lunga lastra di vetro sul contenitore. Bagnare la parte superiore della carta con idrossido di sodio e rimuovere con cura eventuali bolle d'aria sotto la sua superficie. Immergere tre fogli di carta per cromatografia con idrossido di sodio e posizionarli sopra la carta per cartelle.
Rimuovere eventuali bolle d'aria. Capovolgere il gel di seconda dimensione e posizionarlo sopra le carte per cromatografia. Inumidire una membrana di nylon caricata positivamente con acqua deionizzata e posizionarla sopra il gel.
Quindi posizionare tre fogli cromatografici bagnati con acqua deionizzata sulla membrana. Coprire l'idrossido di sodio esposto nel contenitore con pellicola trasparente per evitare l'evaporazione. Posiziona una pila di tovaglioli o tovaglioli di carta alta 0,3-0,5 metri sopra la macchia.
Comprimere l'intera macchia con un peso per facilitare l'azione capillare stretta e lasciarla per due giorni per il trasferimento del DNA alla membrana.
