Per iniziare, prendi 100 milligrammi di fazzoletto fresco o 20 milligrammi di fazzoletto essiccato all'aria e mettilo in una provetta da centrifuga da due millilitri. Posizionare due perline di acciaio inossidabile da cinque millimetri nella provetta da centrifuga e trasferirla in un trituratore di tessuti ad alta produttività funzionante a 60 hertz per 60 secondi. Per l'estrazione del DNA, aggiungere 800 microlitri di tampone di isolamento nucleare pre-raffreddato al campione e posizionarlo su un miscelatore a vortice per cinque minuti.
Quindi, mettere il campione in una centrifuga e centrifugare a 13, 780 g per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il surnatante. Quindi, aggiungere al campione 600 microlitri di tampone P1, seguiti da cinque microlitri di RNasi A.
Dopo il vortex, incubare i campioni in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius per 1,5 ore, capovolgendo le provette due o tre volte durante l'incubazione. Quindi, aggiungere 200 microlitri di Buffer P2. Mescolare accuratamente. E posizionare il campione sul ghiaccio per 15 minuti.
Successivamente, centrifugare a 13, 780 g per 10 minuti. Aspirare con cautela il surnatante su una colonna filtrante AF e centrifugarlo a 13,780 g per due minuti. Trasferire il filtrato inferiore in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.
Dopo aver calcolato il volume del filtrato, aggiungere 1,5 volte il volume del tampone P3 al campione e agitare immediatamente per miscelare il campione. Aggiungere 650 microlitri della miscela preparata in una colonna di assorbimento e incubare per cinque minuti. Quindi, centrifugare a 13, 780 g per 30-60 secondi.
Aggiungere nuovamente il filtrato ottenuto nella colonna di assorbimento. Centrifugare e gettare il liquido di scarto. Lavare la colonna due volte con 600 microlitri di soluzione di risciacquo WB. Dopo la centrifugazione, eliminare il liquido di scarto, quindi posizionare la colonna di assorbimento in una provetta di raccolta vuota.
Dopo aver centrifugato il campione a 13, 780 g per due minuti, lasciarlo a temperatura ambiente per far evaporare l'etanolo residuo. Trasferire la colonna di assorbimento in una provetta da centrifuga pulita da 1,5 millilitri e aggiungere 45 microlitri di acqua deionizzata sterilizzata preriscaldata a 65 gradi Celsius al centro della membrana adsorbente. Cinque minuti dopo, centrifugare la provetta a 13,780 g per due minuti a temperatura ambiente.
Quindi, utilizzare uno spettrofotometro. Determinare la concentrazione di DNA nella soluzione filtrata. I rapporti di assorbanza da OD260 a OD280 variavano da 1,8 a 1,84 e la quantità di DNA superava i 100 nanogrammi per microlitro, confermando la buona qualità del DNA estratto.
