Per iniziare, posizionare i tessuti di topo estratti nella provetta del trituratore di tessuti contenente il 50% di soluzione salina ghiacciata e il 50% di metanolo. Inserire il pestello nel tubo del macinacaffè e ruotarlo delicatamente cinque volte per omogeneizzare il tessuto. Trasferire immediatamente il tessuto omogeneizzato in una provetta da 15 millilitri.
Aggiungere due millilitri di metanolo e un millilitro di idrossilammina molare 0,1 al campione omogeneizzato. Lasciare riposare il composto per 15 minuti a temperatura ambiente. Per l'estrazione dei retinoidi, aggiungere 10 millilitri di esano all'omogeneizzato e agitare il tubo orizzontalmente per almeno 10 secondi.
Centrifugare la miscela di esano omogeneizzato per tre minuti a 1000 x g per separare le fasi. Utilizzando una pipetta, trasferire lo strato di esano in una provetta di vetro separata da 15 millilitri e posizionare il campione in una centrifuga sottovuoto per far evaporare completamente l'esano dal campione estratto. Risospendere i retinoidi essiccati nel tubo da 15 millilitri con 100 microlitri di esano e agitare bene per assicurarsi che tutti i retinoidi siano disciolti.
Pipettare tutti i 100 microlitri di esano nel secondo tubo di vetro e agitare il tubo per sciogliere i retinoidi. Quindi pipettare tutti i 100 microlitri di esano in un singolo vetro inerte per l'analisi HPLC. Configurare l'esecuzione HPLC utilizzando le condizioni appropriate.
Identifica i picchi utilizzando i tempi di ritenzione e gli spettri UV per ogni retinoide di interesse in base agli standard. Utilizzando il sistema di dati cromatografici, integrare i picchi identificati e fare riferimento alla curva standard esterna per quantificare l'analita. Per i cromatogrammi biologici tissutali, integrare manualmente i picchi per tenere conto delle variabilità nei tempi di ritenzione.
Nel cromatogramma dell'occhio del topo di controllo, sono stati identificati il 13-cis-retinale, l'11-cis-retinico, l'all-trans-retinol, l'11-cis-retinolo e l'all-trans-retinolo. Nel cromatogramma dell'occhio di topo trattato con idrossilammina, i tempi di ritenzione sono aumentati. Erano presenti anche isomeri syn e anti di queste retinaldeidi.
Nel cromatogramma del tessuto epatico di topo, il palmitato di retinile e l'all-trans-retinolo sono stati identificati come le principali forme di vitamina A, e che nel sangue di topo hanno mostrato un picco di trans-retinolo. Gli spettri assorbenti UV hanno confermato la presenza di isoforme di retinoidi nei picchi del cromatogramma.
