Il lavoro è stato sostenuto da R01 DC 011582 (AK) e RO1 DC011555 (DJT).

<ol><li> Tirare elettrodi di vetro Tirare elettrodi di vetro <ol><li> Tirare singolo elettrodo barile. Usa vetro singolo barile capillare con filamento e tirare punta ad un diametro di circa 1-2 micrometri, lunghezza albero di 10-12 mm, e la resistenza corrispondente elettrodo di circa 12 MOhm (range 5-20 MOhm), misurato in 0,9% di soluzione di NaCl. Resistenze elettrodo inferiore si tradurrebbe in attività di fondo più e quindi più difficoltà ad isolare l&#39;attività unitaria di singoli neuroni. Per tirare questo elettrodo, utilizzare un estrattore orizzontale o verticale, sia con filamenti di riscaldamento o serpentine di riscaldamento. </li><li> Tirare elettrodo multibarrel. Causa del diametro molto più grande di vetro multibarrel e la necessità di una distribuzione uniforme del calore attorno al multibarrel intero, un estrattore potente con una bobina di diametro maggiore riscaldamento, non un filamento di riscaldamento, è necessario. Una pipetta multibarrel deve essere inserito nel centro del filamento riscaldante con no contattare per la batteria di riscaldamento. Si noti che oltre alle 5 canna pipette qui descritto, a 3 o 7-barile barile pipette sono alternative disponibili in commercio. Tirare vetro per un puntale di circa 10 micrometri di diametro totale, o meno. La punta sarà rotto al giusto diametro nel passaggio successivo, quindi la dimensione esatta punta è meno critico durante il processo d&#39;estrazione che la forma complessiva della punta dell&#39;elettrodo, che dovrebbe essere lunga e relativamente sottile. Vedere l&#39;immagine in figura 1C per la forma desiderata punta dell&#39;elettrodo. Forme elettrodo corto e tozzo (Figura 1B) causerà una notevole quantità di danno tissutale quando avanzare nel cervello, mentre le forme di elettrodi molto lunghi e sottili (Figura 1A) si piega e quindi renderà difficile rompere la punta dell&#39;elettrodo per la corretta diametro (vedi punto 2). </li></ol></li><li> Modifica punte degli elettrodi Modifica punte degli elettrodi. Prima che i due elettrodi possono essere incollati, Devono essere modificati. L&#39;albero del singolo elettrodo deve essere piegata prima di essere attaccato al multibarrel per assicurarsi che l&#39;albero combinato del finito piggy-back elettrodo è il più sottile possibile. Inoltre, la punta dell&#39;elettrodo multibarrel deve essere interrotto per garantire bassa resistenza per ionoforesi. <ol><li> Piegare albero di un elettrodo canna singola di circa 20 gradi. Utilizzare più piccolo possibile, la fiamma del bruciatore Bunsen. Tipici &quot;piccoli&quot; becchi Bunsen da società di fornitura standard di laboratorio creano dei formati di fiamma che sono di gran lunga troppo grande per questa applicazione. Per aggirare questo problema utilizzare il più piccolo bruciatore commerciale Bunsen e fissare un ago di siringa (~ 18 gauge) alla parte superiore del bruciatore, e sigillare la connessione con cemento dentale. Se utilizzato, la fiamma dovrebbe essere difficile da vedere, circa 5 mm o meno di diametro, e circa 8 mm di altezza. Qualsiasi movimento dell&#39;aria nel locale si spegne la fiamma, quindi è una buona idea per azionare il bruciatore in unambiente chiuso, o di utilizzare scudi vento. Spostare l&#39;elettrodo singolo canna attraverso la fiamma piegare di circa 20 gradi. Mirano ad avere la fiamma del bruciatore fondere il vetro nella zona di transizione a circa 10 millimetri di distanza dalla punta dell&#39;elettrodo. Per evitare di fondere la punta dell&#39;elettrodo suggeriamo che l&#39;elettrodo si terrà a circa 45 gradi, punta rivolta verso il basso, e spostare l&#39;elettrodo attraverso la fiamma in modo relativamente rapido. </li><li> Rompere la punta dell&#39;elettrodo multibarrel. Per garantire un controllo visivo, mentre rompere la punta dell&#39;elettrodo, utilizzare un microscopio con un obiettivo minimo di 10x e oculari 10x. Una scala di misura inserito nel oculare saranno necessarie anche per misurare dimensioni di ugello. Attaccare un pezzo di plexiglass al microscopio tale che l&#39;estremità del plexiglass può essere visto in circa un terzo a metà del campo di vista del microscopio. Nel nostro caso, il pezzo plexiglass è di circa 25 x 70 mm e spessore 5 mm e collegato tramite una vite che può essere fissato in un personalizzatoresi thread nella fase microscopio. È importante avere un design che permette l&#39;plexiglass movimento indipendente della slitta. Posizionare l&#39;elettrodo multibarrel in un letto di argilla da modellare su un vetrino, e inserire la diapositiva contenente l&#39;elettrodo nel supporto diapositive palco microscopio. Utilizzando manipolatori xy la fase microscopio, spostare delicatamente la punta dell&#39;elettrodo contro il pezzo in plexiglass, e osservare la rottura della punta attraverso gli oculari del microscopio. Tentativo di rompere in modo pulito la punta del multibarrel per un diametro complessivo di circa 25-35 micrometri. Scartare pipette con diametro punta che si è staccato troppo grande, o punte con interruzioni irregolari. Noi eliminare circa il 30% dei nostri elettrodi multibarrel a causa di forme punta indesiderati. </li></ol></li><li> Montare Piggy-back Elettrodo Montare piggy-back elettrodo. <ol><li> Elettrodi di posizione. Togliere il cilindro di plexiglass utilizzato nel passaggio 2.2 dal palco microscopio. Fissare completatomultibarrel elettrodo nella plastilina su un vetrino, punta rivolta leggermente verso l&#39;alto. Rivolta verso l&#39;alto sarà importante per passo 3,2, l&#39;incollaggio dei due elettrodi. Suggerimenti che puntano a causare la colla di fuggire dalla punta, evitando incollaggio delle punte degli elettrodi. Inserire elettrodo canna singola piegato in porta elettrodo del micromanipolatore misura (Figura 2). Utilizzo di guida visiva e poi la guida microscopica, abbassare l&#39;elettrodo singolo barile sull&#39;elettrodo multibarrel. Il singolo elettrodo deve essere abbassata direttamente nella scanalatura che è formata dalla disposizione delle canne 5, con la punta sporgente della punta della punta multibarrel di circa 5-10 micrometri. Quando si abbassa la canna singola, osservare attentamente l&#39;angolo che si forma tra i due elettrodi. Per i migliori risultati evitare angoli in cui le punte puntano l&#39;uno dall&#39;altro, ma piuttosto il tentativo di abbassare il singolo elettrodo sulla multiplo perfettamente parallelo o anche con la sua puntatoccare il multibarrel primo formando disposizione un &#39;cuneo&#39; MOLTO leggera. Poiché la punta canna singola è molto flessibile, si piega quando il singolo elettrodo si abbassa un po &#39;più dopo che la punta ha raggiunto la superficie superiore dell&#39;elettrodo canna multi, formando una punta pulita composito che ha una piccola quantità di molla costruita in che aiuta a tenere le punte insieme. Tuttavia, se l&#39;angolo tra canna singola e multibarrel elettrodo è troppo ripido (troppo di un cuneo), l&#39;azione della molla sarà troppo alto e piegare verso il basso elettrodi disposizione. </li><li> Alberi elettrodi Colla insieme. Incollare gli alberi dei due elettrodi insieme con cianoacrilato (colla). Mettere una goccia di colla sul lato piccolo di uno stuzzicadenti piatto e elettrodo assemblaggio contatto con la goccia di colla. Iniziare dalla posizione più distale delle punte e spostare lentamente stuzzicadenti con una caduta di colla lungo alberi elettrodi verso le punte degli elettrodi. Usando la colla troppo, o l&#39;applicazione di colla too vicino alle punte degli elettrodi comporta incollaggio aperture elettrodi, rendendo l&#39;elettrodo almeno parzialmente non funzionale. </li><li> Stabilizzare congiunta con il cemento dentale. Miscelare una piccola quantità di cemento dentale e acrilico dentale in un piccolo piatto di plastica usa e getta o di peso in barca, con uno stuzzicadenti piatto. Attendere fino cemento diventa modellabile e applicare una piccola quantità al giunto tra i due elettrodi per stabilizzare l&#39;articolazione (materiale rosa in Figura 3). Attendere circa 15 minuti ad asciugare. </li><li> Rimuovere e conservare elettrodo. Rimuovere con cautela il termine piggy-back primo elettrodo dal supporto micromanipolatore, e quindi staccare dal vetrino, e conservare in un contenitore a prova di polvere. </li></ol></li><li> Preparare le soluzioni di riempimento elettrodi Preparare soluzioni di riempimento dell&#39;elettrodo. Poiché ionoforesi richiede molecole cariche, la maggior parte agenti devono essere disciolto o in un ambiente acido o alcalino (tipicamente unta di circa pH 3-4, o un pH di circa 8-10, rispettivamente). Un certo numero di sostanze chimiche che vengono spesso utilizzati in ionoforesi sono elencati nella Tabella 1. Per gli agenti che non sono elencati nella tabella, determinare dal valore pKa, se sia più facile da usare la molecola in un acido o un ambiente alcalino per mantenere la molecola carica, e sciogliere conseguenza. Per ottenere i migliori risultati, mescolare tutte le soluzioni fresco tutti i giorni. </li><li> Riempire e preparazione Elettrodi Riempire e preparare elettrodi. Appena prima di usare l&#39;elettrodo, back-riempire ogni botte con la sua rispettiva droga, utilizzando fibra di carbonio 28-34 aghi attaccato ad siringhe con filtri per siringa. Riempire le 4 canne esterne del 5 canna configurazione con i farmaci di scelta, e il barile centro con 3M NaCl come un barile di bilanciamento. Riempire il singolo elettrodo di registrazione botte con 3M NaCl pure. Aggiunta di un colorante per la soluzione di NaCl, come veloce verde o rosso fenolo renderà più facile vedere la punta dell&#39;elettrododurante il posizionamento degli elettrodi sulla superficie del cervello. Inserire l&#39;elettrodo nel portaelettrodo della configurazione della registrazione e inserire tutti i fili nelle botti di vetro appropriati. Utilizzare isolato filo d&#39;argento, da cui circa 1 cm di isolamento è stato rimosso alla punta. Ci dovrebbero essere 5 fili per l&#39;elettrodo multibarrel (4 barili droga e un barile di bilanciamento), più il filo amplificatore che deve essere inserito nel singolo elettrodo canna registrazione. </li><li> Attivare moduli pompa Ionoforesi Attivare moduli pompa ionoforesi e testare tutti i barili. La funzione di test elettrodo di ciascun modulo pompa sarà possibile stabilire se la canna elettrodo è funzionale. Per evitare perdite dei farmaci dalle canne quando non in uso, una tensione di ritenzione nella polarità opposta alla carica molecola deve essere applicato. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Descriviamo una tecnica che permette la manipolazione di un microcircuito singolo neurone in vivo, mentre allo stesso tempo permette la registrazione delle risposte del neurone durante la manipolazione sperimentale. Circuiti neurali sono manipolati attraverso l&#39;applicazione iontophoretical di agonisti e antagonisti sinaptici. Il vantaggio principale di ionoforesi oltre espulsione pressione è che ionoforesi non richiede il movimento fisico del fluido da elettrodo nel tessuto neurale, e quindi non vi è alcuna preoccupazione di causare danni tramite la pressione applicata o volume di fluido. Il limite principale di questa tecnica è la mancanza di informazioni sulla concentrazione del farmaco assoluta nel tessuto, e il volume del tessuto affetto. Tuttavia, poiché le quantità di agenti farmacologici espulse con ionoforesi sono molto più piccole e più precisamente con espulsione controllabile di pressione, il recupero dall&#39;applicazione farmaco è in genere molto più veloce di und molto più completo. Microiontophoresis è stato utilizzato con successo in un certo numero di sistemi neuronali sensoriali, e altri, e viene applicato con successo in più aree cerebrali con poca o nessuna elaborazione intrinseca. La ragione è che alcuni dell&#39;agente espulso farmacologico può diffondere dal sito di applicazione ad un neurone adiacente e manipolare le proprietà di risposta del neurone adiacente. La produzione separata di elettrodi canna singola e multi consente la combinazione di elettrodi con proprietà arbitrarie e non correlati. Tirando botti elettrodi insieme e utilizzando alcuni per la registrazione e alcuni scopi ionoforesi produrrebbe punte degli elettrodi con proprietà molto simili, in modo tale che le punte degli elettrodi o sarebbe troppo grande per la registrazione singola cella, o troppo piccolo per applicazione droga. Inoltre, avere la punta della canna singola si estendono oltre le punte degli elettrodi multibarrel di circa 20 micrometri riduce notevolmente il rumore nelle registrazioni, und elimina possibili effetti confondenti di corrente dalle correnti di conservazione o di espulsione sulla cottura del neurone 3. Piggy-back multibarrel elettrodi sono state preventivamente descritte più di 30 anni fa, 4-6 e sono stati utilizzati con successo per analizzare circuiti neurali 7-18 19-29. Pertanto, il metodo di per sé non è nuovo o unico. Tuttavia, i particolari di preparazione e uso di elettrodo sono stati modificati nel corso degli anni, e l&#39;insieme delle istruzioni descritte qui ha dimostrato di essere particolarmente semplice e di successo, e non è stato pubblicato in dettaglio altrove nella letteratura. In particolare, la flessione della punta unico elettrodo canna consente la punta finale del piggy-back elettrodo relativamente sottile (Figura 3) e, quindi, permette di registrazioni da nuclei profondi con minimo danno al cervello, la sporgenza della canna singola elettrodo sopra il multi-elettrodo canna elimina virtualmente tutti valuteeffetti t, che sono stati spesso indicati come svantaggio della tecnica 3. Nuovi dettagli qui presentata come avente la punta dell&#39;elettrodo rivolta verso l&#39;alto durante il processo di incollaggio e di riposo della canna singola nella scanalatura dell&#39;elettrodo multibarrel garantirà un alto tasso di successo nella produzione piggy-back elettrodi. La tecnica è relativamente semplice e in genere può essere masterizzato da un novizio nel giro di pochi giorni.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome della voce </td><td> Fabbricante </td><td> Commento </td><td> Cat. # </td></tr><tr><td> Becco Bunsen </td><td></td><td> Disponibile a partire dal: VWR </td><td> 17928-027 </td></tr><tr><td> Bicomponente cemento dentale: &quot;Cold cura&quot; materiale dentale </td><td> Co-orale-ite Dental Mfg. Co </td><td> Disponibile a partire dal: Sistemi AM, Inc </td><td> 525000 </td></tr><tr><td> Due componenti del cemento dentale: protesi materiale liquido composto di reticolazione </td><td> Co-orale-ite Dental Mfg. Co </td><td> Disponibile a partire dal: Sistemi AM, Inc </td><td> 525000 </td></tr><tr><td> Colla liquida </td><td> Henkel </td><td> Disponibile a partire dal: Loctite Super Glue </td><td> 01-06849 </td></tr><tr><td> Micro-Ionoforesi Unesso: Neurophore BH-2 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Disponibile a partire dal: Harvard Apparatus </td><td> 65-0200 e 65-0203 </td></tr><tr><td> Argento filo isolato </td><td> AM-Systems </td><td> Disponibile da: AM-Systems </td><td> 785500 </td></tr><tr><td> Estrattore orizzontale </td><td> Zeitz DMZ-Universal Puller </td><td> Disponibile a partire dal: AutoMate Scientific </td><td> NA </td></tr><tr><td> Micro-manipolatore pezzi: porta elettrodo </td><td> WPI </td><td> Disponibile a partire dal: WPI </td><td> M3301EH </td></tr><tr><td> Micro-manipolatore pezzi: fase lineare </td><td> Newport 423 Series </td><td> Disponibile a partire dal: Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Micro-manipolatore pezzi: rotazione fase </td><td> Newport RSP-2 </td><td> Disponibile a partire dal:Newport </td><td> RSP-2 </td></tr><tr><td> Micro-manipolatore pezzi: traduzione z </td><td> Newport 433 Series </td><td> Disponibile a partire dal: Newport </td><td> 433 </td></tr><tr><td> Micro-manipolatore pezzi: parentesi angolare di 90 ° da montare xy z e l&#39;asse </td><td> Newport 360-90 </td><td> Disponibile a partire dal: Newport </td><td> 360-90 </td></tr><tr><td> Micro-manipolatore pezzi: traduzione x / lineare fase </td><td> Newport 423 Series </td><td> Disponibile a partire dal: Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Micro-manipolatore pezzi: traduzione y / lineare fase </td><td> Newport 423 </td><td> Disponibile a partire dal: Serie Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Leitz Laborlux 11 </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> Microscopio: obiettivo </td><td> Leitz Wetzlar 10x, NA 0,25 </td><td></td><td> 519760 </td></tr><tr><td> Microscopio: eypieces </td><td> Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18 </td><td></td><td> 519748 </td></tr><tr><td> Microscopio: stage </td><td> Leitz Wetzlar </td><td></td><td> 513544 </td></tr><tr><td> Multibarrel capillare </td><td> N / A </td><td> Disponibile a partire dal: sistemi AM, Inc </td><td> 612000 </td></tr><tr><td> Sinlge barile capillare (GC 150F-10) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Disponibile a partire dal: Harvard Apparatus </td><td> 30-0057 </td></tr><tr><td> Estrattore verticale </td><td> Narishige modello PE-2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Elementi realizzati su misura del micro-manipolatore (contrassegnato luce blue in Figura 1) </td><td></td></tr><tr><td> lamiera di acciaio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> base orientabile </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> attacco per portaelettrodo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Produttori Tabella 2. E numeri articolo di tutte le attrezzature e materiali di consumo utilizzati nella procedura. </td><td></td></tr></tbody></table>

manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses

Nelle registrazioni di singoli neuroni in vivo permette un investigatore per esaminare le proprietà dei neuroni, per esempio in risposta a stimoli sensoriali. I neuroni in genere ricevono più ingressi eccitatori e inibitori afferenti e / o efferenti che si integrano tra di loro, e le proprietà finali di risposta misurati del neurone sono guidati dalle integrazioni neurali di questi ingressi. Per studiare l&#39;elaborazione delle informazioni in sistemi neuronali, è necessario comprendere i vari ingressi di un neurone o sistema neurale, e le proprietà specifiche di tali ingressi. Un metodo efficace e tecnicamente relativamente semplice per valutare il ruolo funzionale di taluni fattori che un neurone dato sta ricevendo è quello di sopprimere in modo dinamico e reversibile o eliminare questi ingressi, e misurare le variazioni della produzione del neurone causati da questa manipolazione. Ciò può essere ottenuto alterando farmacologicamente ambiente circostante del neurone con piggy-back multibarrel elettrodi. Questi elettrodi sono costituiti da un singolo elettrodo di registrazione canna e un elettrodo multibarrel farmaco che può trasportare fino a quattro diversi agonisti o antagonisti sinaptici. Gli agenti farmacologici possono essere applicati iontophoretically momenti desiderati durante l&#39;esperimento, consentendo temporizzata consegna e riconfigurazione reversibile di ingressi sinaptici. In quanto tale, la manipolazione farmacologica del microambiente rappresenta un metodo efficace e senza precedenti per testare specifiche ipotesi sulla funzione del circuito neurale. Qui si descrive come piggy-back elettrodi sono realizzati, e in che modo vengono utilizzati durante gli esperimenti in vivo. Il piggy-back sistema consente un investigatore di combinare un singolo elettrodo di registrazione barile di qualsiasi proprietà arbitraria (resistenza, dimensioni della punta, ecc forma) con un elettrodo di droga multibarrel. Questo è un grande vantaggio rispetto ai normali multi-elettrodi, in cui tutte le canne hanno più o meno le forme e proprietà simili. Multibarrel electrodes sono stati introdotti più di 40 anni fa 1-3, e sono stati sottoposti a una serie di miglioramenti di progettazione 2,3 fino a quando il tipo piggy-back è stato introdotto nel 1980 4,5. Qui vi presentiamo una serie di importanti miglioramenti nella produzione laboratorio di piggy-back elettrodi che permettono la penetrazione cerebrale profonda in intatto in preparati animali in vivo a causa di un albero elettrodo relativamente sottile che provoca un danno minimo. Inoltre questi elettrodi sono caratterizzati da registrazioni a basso rumore, e hanno bassa resistenza ai farmaci botti per ionoforesi molto efficace di agenti farmacologici desiderati.

In questo esperimento, il cloridrato di glicina recettore antagonista stricnina è stata iontophoretically applicata. Blocco inibizione glycinergic in genere aumenta la cottura nei neuroni. Figura 4 mostra i dati di esempio da un neurone uditivo cui risposte a stimoli sonori sinusoidali di intensità crescente consegnato alle orecchie dell&#39;animale sono stati registrati. Questo tipo di esperimento è denominato neurone funzione rate a scarica vs. Suoni più forti, ha determinato un aumento dei tassi di spike (curva nera). L&#39;attuale ionoforesi iniziale usato in questo esperimento era di 15 nA. Dopo che la corrente è stata accesa e le variazioni nella funzione dell&#39;intensità tasso era stabilizzato al loro nuovo livello (curva blu scuro), la corrente di espulsione è stata progressivamente aumentata a 30, 45, e 60 nA (arancione, verde, blu e curve di luce, rispettivamente). In ogni caso, le risposte del neurone nello stesso intervallo di intensità acustica sono stati registrati dopo i cambiamenti nel dischaRGE tasso intensità funzioni in risposta alla corrente di eiezione nuova era stabilizzato. L&#39;espulsione più appropriato corrente per utilizzare in questo esempio era di 45 nA a 60 nA perché questi livelli di corrente non alterare in modo diverso le risposte del neurone. Questo risultato suggerisce che a 45 nA di corrente, tutti i recettori della glicina del neurone che era già stato bloccato da stricnina cloridrato. Qualsiasi ulteriore aumento della stricnina espulsione corrente e rilasciando ancora più non ha dato luogo ad un ulteriore cambiamento del neurone tasso di scarico a livello di funzione. Dopo il completamento del protocollo, la corrente di espulsione è stato spento. Il recupero delle risposte neurali torna al basale è stato raggiunto dopo circa 25 min (linea rossa). Questo potrebbe richiedere, a seconda del tipo e della quantità di farmaco espulso, tra alcuni secondi e diverse decine di minuti. <table border="1"><tbody><tr><td> Droga </td><td> Concentrazione </td><td> pH di una soluzione </td><td> Solvente </td><td> Azienda </td><td> Cat. # </td><td> Ritenzione tipica corrente </td><td> Correnti di espulsione tipici </td></tr><tr><td> GABA </td><td> 500 mM </td><td> 3,5-4,0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> A-2129 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA a +100 nA </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> 100 mM </td><td> 3,5-4,0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> G-7126 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA a +100 nA </td></tr><tr><td> Bicucullina Methiodide </td><td> 10 mM </td><td> 3,0 </td><td> 0,165 M NaCl in dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> B-6889 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA a 60 nA </td></tr><tr><td> Strychnine cloridrato </td><td> 10 mM </td><td> 3,0 </td><td> 0,165 M NaCl in dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> S-8753 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA a +80 nA </td></tr><tr><td> Acido L-glutammico </td><td> 500 mM </td><td> 8.0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> G-1251 </td><td> 30 nA </td><td> -10 A -150 nA nA </td></tr><tr><td> L-aspartico </td><td> 500 mM </td><td> 8.0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> A-8949 </td><td> 30 nA </td><td> -10 A -150 nA nA </td></tr><tr><td> Acid cainico </td><td> 1 mM </td><td> 9.0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> K-0250 </td><td> 30 nA </td><td> -10nA a -100 nA </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Farmaci comunemente usati, con pH per la dissoluzione e la concentrazione. La tabella elenca i più comunemente utilizzati agonisti ed antagonisti dei recettori sinaptici utilizzati con ionoforesi. L&#39;ambiente di pH indicato conti per la necessità di polarizzare t<html> ueste agenti, e nei conti di concentrazione proposti per la variabilità di efficacia tra diversi farmaci. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig1.jpg" /> Figura 1. Tre multibarrel pipette con diverse lunghezze di punta A:. La punta di questo hotel a 5-barrel elettrodo è stato tirato troppo a lungo e sottile. Si noti che la punta è piegato e molto morbido. Questo tipo di punta è molto difficile rompere al diametro desiderato. B: La punta di questo elettrodo è troppo corto e tozzo. Quando avanzare in aree cerebrali profonde, questo elettrodo causerà inutili danni cerebrali a causa del fatto che l&#39;elettrodo diventa relativamente spessa pochi millimetri dopo la punta. C: Un esempio di un elettrodo a punta correttamente tirato. Pur essendo lunga e sottile, la punta è ancora fermo e può essere rotto facilmente al diametro della punta desiderata. gura 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Disegno di gruppo di elettrodi manipolatore. L&#39;assemblea manipolatore viene utilizzato insieme con un microscopio per assemblare i piggy-back elettrodi. Elementi contrassegnati in grigio sono prodotti disponibili in commercio e sono elencati nella Tabella 2. Gli elementi contrassegnati in blu sono stati lavorati su misura in officina della nostra Istituzione. Essi sono: 1) 1/4 di pollice a piastre in acciaio di dimensioni 43x26 centimetri con fori per la fase Newport 423 forato in esso secondo lo schema dei fori fornito da Newport, 2) una fase di inclinazione che permette di inclinazione del gruppo ad angoli arbitrari, 3) un connettore che monta il porta elettrodo alla fase superiore traslazionale. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig3.jpg" /> Figura 3. Foto di un elettrodo campione piggy-back. Un finito 5 barile elettrodo assemblato insieme ad una registrazione el singolo barileectrode. Nota albero lungo di circa 7 mm consentendo un registrazioni cerebrali profonde. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig4.jpg" /> Figura 4. Titolazione delle correnti di espulsione. Il grafico mostra il tasso di intensità funzioni registrate da un neurone uditivo singolo mentre le orecchie dell&#39;animale sono state stimolate con toni di varia intensità. Suoni più forti, tendeva ad indurre tassi più elevati di cottura. Prima dell&#39;applicazione della droga, del neurone tasso di intensità funzione ha le tariffe più basse spike (curva nera). Correnti di espulsione progressivamente più elevati bloccati progressivamente più recettori glicina al neurone, con conseguente tasso di cottura progressivamente più elevati. L&#39;espulsione ottimale corrente in questo neurone era 45-60 nA. Con queste correnti di espulsione, il blocco completo di tutti i recettori della glicina del neurone è stato raggiunto. Dopo il completamento del protocollo sperimentale, la ionoforesi è stato chiuso e il neurone è stato permesso direcuperare. Il recupero completo è stato raggiunto quando il tasso di intensità funzione di recupero abbinato il primo pre-farmaco funzione di recupero. Riprodotto, con il permesso della American Physiological Society, da Klug et al, 1995.

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Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

Ionoforesi di agonisti ed antagonisti neurali durante extracellulare<em&gt; In vivo</em&gt; Registrazioni è un potente mezzo per manipolare microambiente di un neurone. Queste manipolazioni possono più facilmente essere fatta tramite piggy-back multibarrel elettrodi. Qui si descrive come la loro fabbricazione e utilizzarli durante le registrazioni uditive.

Produzione e utilizzo di Piggy-back Multibarrel Elettrodi per<em&gt; In vivo</em&gt; Manipolazioni farmacologiche di risposte neurali

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

10.4K Views.  University of Colorado Medical Campus. Ionoforesi di agonisti ed antagonisti neurali durante extracellulare In vivo Registrazioni è un potente mezzo per manipolare microambiente di un neurone. Queste manipolazioni possono più facilmente essere fatta tramite piggy-back multibarrel elettrodi. Qui si descrive come la loro fabbricazione e utilizzarli durante le registrazioni uditive.

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo</emImaging> della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Ricerca

Neuroscienze

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

Combinando comportamentali Endocrinologia ed Economia Sperimentale: Decisione testosterone e sociale Fare

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

Impianto chirurgico di elettrodi neurali cronici per la registrazione di attività singola unità e segnali Electrocorticographic

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Preparazione di un mouse Awake per la registrazione di risposte neurali e iniezione Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Analisi funzionale del circuito di alimentazione larvale in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant characteristics.&#160;This precludes a rational selection of a particular implant as optimal for a particular application and the development of new materials based on the most critical performance parameters.&#160;This article develops a protocol for in vitro and in vivo testing of neural recording electrodes.&#160;Recommended parameters for electrochemical and electrophysiological testing are documented with the key steps and potential issues discussed.&#160;This method eliminates or reduces the impact of many systematic errors present in simpler in vivo testing paradigms, especially variations in electrode/neuron distance and between animal models.&#160;The result is a strong correlation between the critical in vitro and in vivo responses, such as impedance and signal-to-noise ratio.&#160;This protocol can easily be adapted to test other electrode materials and designs.&#160;The in vitro techniques can be expanded to any other nondestructive method to determine further important performance indicators.&#160;The principles used for the surgical approach in the auditory pathway can also be modified to other neural regions or tissue.

Different electrode coatings affect neural recording performance through changes to electrochemical, chemical and mechanical properties. Comparison of electrodes in vitro is relatively simple, however comparison of in vivo response is typically complicated by variations in electrode/neuron distance and between animals. This article provides a robust method to compare neural recording electrodes.

Un metodo per la sistematica elettrochimici ed elettrofisiologiche di valutazione dei neurali registrazione elettrodi

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...