Vorremmo ringraziare Sarah Dick per la fornitura di lettura critica e commenti. MAR detiene il Canada Research Chair in Genetica Molecolare ed è un Research Scholar Internazionale del Howard Hughes Medical Institute. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni al MAR dal National Institutes of Health, l&#39;Howard Hughes Medical Institute, il Canadian Institutes of Health Research, l&#39;Associazione distrofia muscolare e il programma di ricerca del Canada presidente.

Tutti gli esperimenti sono stati trattati secondo l&#39;Università di regolamenti di Ottawa per la cura degli animali e la gestione. Vedi Tabella 1 per una panoramica del protocollo. 1. Prima di avviare l&#39;isolamento <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni: Collagenasi di tipo I 0,2% in DMEM (Dulbecco modified Eagle medium; glucosio, L-glutammina, con 110 mg / ml di piruvato di sodio). Per due muscoli EDL preparare 2 ml di 0,2% Collagenease in DMEM. Filtrare la soluzione attraverso filtro 0,22 micron. 10 minuti prima l&#39;isolamento, preriscaldata a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. Aliquote supplementari collagenasi non diluito può essere congelato a -20 ° C per un uso successivo. Nota: utilizzare DMEM con piruvato di sodio in tutta la procedura. Fibre non sopravvivono in sodio piruvato terreno privo. <ul><li> Mezzi di lavaggio (utilizzare per eseguire tutti i lavaggi). Supplemento DMEM con 1% di penicillina / streptomicina. Filtrare su 00,22 micron filtro prima dell&#39;uso. </li><li> Miofibre cultura dei media. Supplemento DMEM con 20% FBS, 1% estratto di embrioni di pollo e 1% di penicillina / streptomicina. Filtrare su filtro 0,22 micron prima dell&#39;uso. </li><li> Matrigel piatti rivestiti. Per le fibre di cultura per lungo periodo di tempo, si consiglia di utilizzare come substrato Matrigel rivestimento. Per preparare piatti rivestite Matrigel, scongelare un&#39;aliquota di Matrigel a 4 ° C per una notte. Il giorno dopo, Matrigel diluire 1:10 in DMEM. Tenere Matrigel a 4 ° C in ogni momento e di evitare sbalzi termici come questo creerà microscopici cristalli all&#39;interno del Matrigel soluzione risultante non uniforme. Piatti posto da rivestire su ghiaccio. Piatti Cappotto con volume appena sufficiente a coprire la superficie. Lasciate riposare per 1 minuto. Rimuovere completamente il Matrigel residuo. Lasciate asciugare i piatti a 37 ° C per almeno 3 ore prima dell&#39;uso o durante la notte. </li></ul> Nota: aliquote di Matrigel diluita può essere riutilizzato più volte per fini rivestimento, se conservati a 4 &amp; deg; C. </li><li> Infine, assicurarsi di pulire la stazione di microscopio e strumenti di dissezione con il 70% di etanolo. </li><li> Per due isolamenti EDL (un mouse) preparare cinque piatti di plastica Petri (60 * 15mm) come segue: <ul><li> Quattro piatti per l&#39;isolamento (1 per il muscolo dissociazione, 3 per lavaggi seriali). Tutti i piatti devono essere protette con siero di cavallo (HS) per evitare miofibre di attaccarsi alla plastica. Per cappotto, Pipettare 3 ml di siero di cavallo in ogni ricciolo piatto, per consentire anche rivestimento, rimuovere il siero di cavallo e lasciare il piatto asciugare per almeno 30 min. Aggiungere 4 ml di DMEM ad ogni piatto. Mantenere piatti a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore prima dell&#39;uso. </li></ul> Nota: siero di cavallo può essere riutilizzato più volte, se mantenuto sterile. In alternativa, una soluzione del 10% in DMEM HS può essere usata per rivestire i piatti. Usare piatti HS rivestite in tutto l&#39;intero protocollo e quando miofibre coltura sulle condizioni di galleggianti. <ul><li> Un piatto sarà utilizzato per miofibre coltura dopo l&#39;isolamento. Altdimensioni della parabola ernative o formati può essere utilizzato per la coltura finale di miofibre seconda applicazioni a valle. Tuttavia, non suggeriscono dimensioni della parabola di dimensioni superiori a 60 * 15 mm. Miofibre possono essere mantenute in sospensione per non più di 96 ore prima contrazione iper verifica. Per tempi più lunghi della cultura, si consiglia di utilizzare Matrigel piatti rivestiti o piastre. </li></ul></li><li> Per un isolamento in fibra (2 EDL), preparare due pipette Pasteur sterili: una pipetta di grande diametro per la manipolazione dei muscoli e una pipetta di piccolo diametro per la manipolazione delle miofibre. Utilizzare una penna di diamante per tagliare ogni pipetta di vetro per la lunghezza desiderata e lucidare il calore per lisciare pipetta bordi. Mediante la fiamma, curva la punta della pipetta di piccolo diametro. Questo vi aiuterà a gestire singole fibre. Fiamma per sterilizzare. Cappotto ogni pipetta con HS prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Dissezione muscolare e digestione <ol><li> Ai fini di questi esperimenti, 8 settimane di età SV129, Pax7 créer Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) e Myf5-Cre; Rosa26YFP sono stati utilizzati. </li><li> Spruzzare arti posteriori con il 70% di etanolo. Pin l&#39;animale (faccia in su) ad un forum di supporto per avere una migliore comprensione del dell&#39;arto posteriore durante la procedura. </li><li> Con l&#39;aiuto di forbici, tagliare l&#39;intera lunghezza dell&#39;arto e esporre il muscolo sottostante. Togliere la pelle così come tutti i capelli o pelliccia (Figura 1A). </li><li> Con una forbice fine, tagliare la fascia sottile senza danneggiare i muscoli sottostanti. Visivamente localizzare l&#39;EDL. L&#39;EDL si trova nel vano anteriore della dell&#39;arto posteriore appena sotto il tibiale anteriore (TA) muscolare. </li><li> Con l&#39;aiuto di due pinze, esporre i tendini distali. </li><li> Tagliare i tendini distali (sia del TA e EDL) con taglienti Cohann-Vännäs forbici a molla. </li><li> Con l&#39;aiuto di pinze da contenere sia TA e dei muscoli EDL dai loro tendini e delicatamente tirare i muscoli verso l&#39;estremità prossimale. A questo punto dovreste essere in grado di vedere chiaramenteil muscolo EDL proprio sotto il muscolo TA. Ora, separare il EDL dal muscolo TA tirando i due tendini in direzioni opposte (figura 1B). Evitare di stiramento del muscolo EDL durante l&#39;esecuzione di questa operazione per evitare di danneggiare le miofibre. </li><li> Esporre il tendine EDL. Per visualizzare meglio il tendine prossimale può contribuire a questo punto per rimuovere il muscolo TA. Esso può anche aiutare a tagliare un po &#39;di tessuto connettivo del tutto il ginocchio (Figura 1C). </li><li> Tagliare il tendine prossimale e rimuovere delicatamente la EDL (Figura 1D). </li><li> Tenendo il muscolo attraverso i tendini, trasferirlo in 2 ml di soluzione di collagenasi precedentemente preparata. Incubare a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. Nota: per l&#39;isolamento in fibra di successo, è importante isolare il EDL da tendine a tendine in modo che l&#39;integrità delle miofibre viene mantenuta. Passi 2,3-2,9 può essere eseguita sotto un microscopio da dissezione. In alternativa, l&#39;uso di un magnficare vetro può anche aiutare ad avere una visione migliore dei muscoli. </li><li> Ripetere i passaggi 2,3-2,9 per isolare la EDL secondo. Trasferire la EDL secondo nel tubo stesso. Per evitare la digestione irregolare, isolamento della EDL secondo dovrebbe essere completato non più di 5 minuti dopo la prima. Nota 1: il tempo di incubazione può essere necessario modificare a seconda dell&#39;attività collagenasi. Incubazione più lungo o più corto potrebbe essere necessario a seconda dell&#39;età dimensioni, e / o condizione muscolare (ad esempio, i muscoli fibrotici bisogno di tempo di digestione più lungo). Nota 2: Se l&#39;esame satellitare comportamento delle cellule in condizioni di quiescenza, durante il tempo di agitazione muscolare digestione possono attivare le cellule satelliti 10. </li><li> Durante il tempo di digestione, controllare regolarmente il muscolo per evitare un eccesso di digestione. Arrestare la digestione quando i muscoli cominciano a rilassarsi e miofibre sono visibili. Per arrestare la digestione, trasferire accuratamente entrambi i muscoli ad un piatto preriscaldato Petri con 4 ml di DMEM (dissociatisul piatto). Usare la pipetta grande diametro per eseguire questa operazione. Nota: evitare di overdigestion muscolare come questo inevitabilmente comporta l&#39;isolamento di iper miofibre contratto. </li></ol> 3. Singolo miofibre Dissociazione e Cultura <ol><li> Per rilasciare miofibre, utilizzare la pipetta di vetro di grandi dimensioni foro per irrigare il muscolo con il mezzo caldo fino a quando le fibre naturalmente iniziano ad essere rilasciato. Non triturare il muscolo in quanto ciò si tradurrà inevitabilmente in fibre dannose. Eseguire questa e le seguenti operazioni sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Continua il rilascio miofibre finché il numero desiderato. Se il piatto è richiesto a temperatura ambiente per più di 10 min consentire un 5 min (minimo) incubazione a 37 ° C, 5% di CO 2 di riequilibrare il mezzo. Nota: se il prodotto raggiunge temperature inferiori fisiologica (37 ° C) per un periodo di tempo prolungato miofibre morirà. </li><li> Con le piccole dimensioni del foro pipetta, transfer vivere miofibre singole per un nuovo piatto preriscaldato (primo di tre lavaggi consecutivi). Gestire ogni miofibre singolarmente invece di trasferire maggior parte delle miofibre tutto in una volta. Se necessario, incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 10-15 min a riequilibrare il mezzo. </li><li> Ripetere il punto 3.3 per altre 2 volte o fino a quando tutte le miofibre morti e detriti vengono rimossi. Si consiglia almeno tre lavaggi consecutivi per una corretta pulizia. Nota: miofibre morte apparirà come breve e iper contratta sotto la luce microscopio. </li><li> Incubare miofibre singole a 37 ° C, 5% di CO 2 nel piatto ultimo lavaggio (DMEM solo) per almeno un ora prima del passaggio a mezzo di coltura. Ciò consente di regolare miofibre alla condizioni in vitro in assenza di siero. Abbiamo scoperto che la cultura immediata di miofibre nel siero terreno ricco di fibre aumenta il restringimento. </li><li> Dopo un ora, trasferire miofibre di un nuovo piatto preriscaldato o nel formato appropriato culturaa seconda dell&#39;applicazione a valle. Fibre di cultura in alta media siero per consentire l&#39;attivazione delle cellule satellite. In alternativa, diverse concentrazioni di siero o embrione di pollo estratto può essere utilizzato. Cambiare mezzo ogni altro giorno. </li></ol> 4. Applicazioni a valle <ol><li> Immunostaining. Miofibre vivi possono essere fissate e colorate in qualsiasi punto nel tempo durante l&#39;isolamento. Immunofluorescenza può essere eseguita su miofibre sia galleggianti e substrato collegata. Se la colorazione miofibre galleggianti, usare una pipetta di vetro piccolo foro per trasferire miofibre da una soluzione ad un&#39;altra. In alternativa, è possibile mantenere miofibre nello stesso pozzo in tutta la procedura e aggiungere / rimuovere soluzioni utilizzando una pipetta di vetro. Evitare aspirazione standard come questo comporta la rimozione delle miofibre pure. In breve, rimuovere completamente terreno di coltura; miofibre fix preriscaldato in paraformaldeide 4% (PFA) per 5 min. Ampiamente lavare in PBS più volte. Incubazionemiofibre te in 1% glicina in PBS o altre soluzioni standard di tempra per minimizzare la colorazione di fondo PFA. Se necessario, permeabilize miofibre con 0,1% Triton X-100 in PBS per 10 min seguito da un lavaggio in PBS 5 min. Incubare le fibre in una soluzione bloccante (10% siero di cavallo, 0,1% Triton X-100, 1% NaN) per 1 ora a temperatura ambiente o preferibilmente durante la notte a 4 ° C. Soluzioni alternative di bloccaggio possono essere utilizzati, a seconda del anticorpo di interesse. Lavare una volta in PBS per 5 min. Incubare con l&#39;anticorpo primario diluito in una soluzione bloccante per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. Lavare le fibre 3 volte a 5 minuti a lavaggio in PBS per rimuovere qualsiasi anticorpo non legato. Incubare con l&#39;appropriato anticorpo secondario per 45 minuti a 1 ora a temperatura ambiente. Lavare 3 volte in 5 minuti per lavaggio in PBS. Controcolorare nuclei con 1 mg / ml DAPI. Se la colorazione delle fibre flottanti, trasferire ciascuna fibra ad un vetrino adatto per microscopia. Eliminare l&#39;eccesso di PBS o media. Applicare montaggio medium e quindi aggiungere il coprioggetto. Procedere per visualizzare miofibre sotto un microscopio a fluorescenza. Vedere la Figura 4 per immunofluorescenza rappresentante a miofibre EDL. Procedure di colorazione alternativi utilizzando forti fissativi sono descritti in Verma, M. et al. 11 e Wosniak, CA et al. 12. </li><li> Oligonucleotide o plasmide trasfezione transiente. Miofibre Live possono essere trasfettate con siRNA plasmide o per specifico gene / s di interesse. Quando si utilizza siRNA, trasfezione doppio è consigliato per knockdown gene efficiente. Si consiglia di eseguire la trasfezione prima volta dopo 8 ore dall&#39;isolamento. Sei ore dopo la trasfezione, sostituirlo con terreno fresco. Per la trasfezione siRNA, suggeriamo partenza utilizzando una concentrazione finale di 50 nM. Espressione knockdown gene può essere analizzata mediante estrazione dell&#39;RNA o preferibilmente mediante immunocolorazione. </li><li> Infezione virale. Infezione di miofibre vivi è possibile anche se l&#39;incidenza di cellamorte è superiore a trasfezione con oligo e l&#39;efficienza di infezione può essere variabile a seconda delle condizioni muscolari ed età. Per esempio, intatte miofibre muscolari adulti non sono particolarmente sensibili alle infezioni virali per la presenza della lamina basale, che ha dimostrato di fornire una barriera protettiva contro le infezioni ospite 13, 14. Vettori lentivirali sono da preferire rispetto vettori retrovirali in quanto possono infettare le cellule quiescenti (non mitotico). Per l&#39;infezione virale, si consiglia di fibre di cultura su un piatto rivestito Matrigel o targa e lasciare miofibre adeguarsi alle condizioni del supporto per le prime 24 ore. </li><li> Vivo Imaging. Vivo imaging di miofibre è particolarmente lunga e richiede un microscopio dotato di 37 ° C, 5% di CO 2 camera. È utile per valutare il comportamento di singole cellule satelliti. Il lavoro svolto con questa tecnica è stato determinante per la scoperta di eterogeneità delle cellule satellite e studiare la loro BehaVior su fibre (15 e 16). </li></ol>

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Non ci sono interessi in gioco.

L&#39;isolamento e la coltura di singole miofibre di muscoli intatti fornisce un eccellente modello in vitro per studiare il processo di rigenerazione muscolare. Una caratteristica unica di questo sistema è la conservazione di cellule satelliti nel loro ambiente fisiologico sotto la lamina basale. Soprattutto, la tecnica può essere usato per studiare il comportamento delle cellule muscolari staminali sia quiescenza e stati attivati. Negli ultimi 20 anni, il sistema cultura miofibre ha fornito indicazioni significative sulla biologia della popolazione di cellule satellite rispetto ad entrambi determinanti intrinseci ed estrinseci. Da miofibre singoli coltura, eterogeneità cellula satellite rispetto al miofibre, tipo di muscolo o potenziale rigenerativo è stato affrontato 15. Elaborare studi che utilizzano l&#39;imaging dal vivo di singole fibre coltivate consentiti per ottenere le informazioni sul modello di migrazione delle cellule satellite 16. L&#39;acquisizione dei dati quantitativi èLSO possibile. Anche se richiede tempo, fornisce informazioni significative sulla distribuzione e verificarsi di eventi specifici (cellule staminali asimmetrico rapporto di divisione, proliferazione e differenziazione, ecc). Insieme con applicazioni precedentemente descritte, proteina o l&#39;estrazione di RNA da singole fibre è anche possibile, sebbene isolamento di popolazione pura di cellule satelliti da FACS o altri mezzi possono fornire una migliore piattaforma per analizzare le variazioni di espressione della proteina o del gene a livello molecolare. Nella nostra esperienza, la fase più critica per l&#39;isolamento in fibra di successo è il &quot;tendine a tendine&quot; isolamento (passi 2,5-2,9 nel testo del protocollo). Questo garantisce che, dopo la digestione muscolari, fibre vengono rilasciati dalla EDL con minimo danno o no aumentando così le loro prestazioni nei seguenti passi.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente / Materiale </td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-1g </td><td> Preparare freschi tutti i tempi per ottenere risultati ottimali. Aliquote addizionali di collagenasi non diluito può essere conservato a -20 ° C. </td></tr><tr><td> DMEM alta glucosio + NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> Aggiunta di Pen / Strep è necessario minimizzare contaminazioni dell&#39;aria </td></tr><tr><td> Caratterizzato siero fetale bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> Lot # KUJ35152 </td></tr><tr><td> Siero di cavallo </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> Lot # AVJ82494 </td></tr><tr><td> Embrione di pollo estratto </td><td> Chimica accurata </td><td> CE-650-T, Batch B7035010 </td><td> Evitare il congelamento-scongelamento cicli. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> Aliquote Conservare a -20 ° C. Evitare il congelamento-scongelamento cicli. Conservare aliquote diluiti a 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Cohann-Vannas Primavera Scissor 6 millimetri Lame-Straight-Sharp </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Extra sottile Iris Forbici-10,5 centimetri </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Moria-Iris pinze curve </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11373-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur Pipette </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> Diamante Pen </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15 millimetri Petri </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc 0,22 micron filtro </td&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione Microscopio StemiV6 </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Una fonte di luce supplementare può essere richiesto di avere una visione migliore messa a fuoco </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle

Rigenerazione muscolare nell&#39;adulto viene eseguita da cellule staminali residenti chiamate cellule satelliti. Cellule satellite sono definite dalla loro posizione fra la lamina basale ed il sarcolemma delle miofibre ciascuna. Le attuali conoscenze del loro comportamento si basa molto sull&#39;utilizzo del protocollo unico di isolamento miofibre. Nel 1985, Bischoff descritto un protocollo per isolare singole fibre vivi dalla digitorum Flexor Brevis (FDB) di ratti adulti con l&#39;obiettivo di creare un sistema in vitro in cui è conservata l&#39;associazione fisica tra il miofibre e le cellule staminali 1. Nel 1995, il protocollo Rosenblattmodified Bischoff tale che miofibre vengono prelevati singolarmente e manipolati separatamente dopo digestione con collagenasi invece di essere isolato mediante sedimentazione gravitazionale 2, 3. Il Rosenblatt o Bischoff protocollo è stato poi adattato per diversi muscoli, età o condizioni 3-6. Il singolo tecnica di isolamento miofibre è indispensabilestrumento grazie i suoi vantaggi unici. Primo, nel singolo protocollo miofibre, cellule satelliti sono mantenute sotto la lamina basale. Questa è una caratteristica unica del protocollo, come altre tecniche come la fluorescenza activated cell sorting richiedono chimica e meccanica dei tessuti dissociazione 7. Anche se il sistema di coltura miofibre non possono sostituire gli studi in vivo, esso offre una piattaforma eccellente per affrontare le pertinenti caratteristiche biologiche delle cellule staminali muscolari. Miofibre singoli possono essere coltivate in condizioni standard o placcatura in condizioni galleggianti. Le cellule satellite su miofibre galleggianti sono sottoposti a pratica nessun effetto diverso l&#39;ambiente miofibre. Rigidità substrato e rivestimento hanno dimostrato la capacità di influenzare le cellule satelliti di rigenerarsi muscoli 8, 9 in modo da essere in grado di controllare ciascuno di questi fattori permette indipendentemente discriminazione tra nicchia-dipendente e-indipendenti risposte. Diverse concentrazioni di siero hannoanche dimostrato di avere un effetto sulla transizione dalla quiete per l&#39;attivazione. Per mantenere lo stato di quiescenza delle sue cellule satellitari correlati, le fibre devono essere tenuti in condizioni di scarsa media siero 1-3. Ciò è particolarmente utile quando si studiano i geni coinvolti nello stato di quiescenza. Nel siero terreno ricco, le cellule satellite attivare rapidamente, proliferano, migrano e si differenziano, quindi imitando il processo nel vivo rigenerativo 1-3. Il sistema può essere utilizzato per eseguire una varietà di saggi quali il test di inibitori chimici; espressione ectopica di geni di consegna virus; oligonucleotide gene basata knock-down o imaging vivo. In questo articolo il video descrive il protocollo attualmente in uso nel nostro laboratorio per isolare singole miofibre dal estensore lungo delle dita (EDL) muscolo di topi adulti (6-8 settimane).

Qui abbiamo descritto l&#39;isolamento di singole miofibre dal muscolo EDL di topi adulti. Miofibre di successo resa dipende da diversi fattori, come l&#39;attività collagenasi o condizioni muscolari o di età. Soprattutto, l&#39;isolamento del muscolo da tendine a risultati tendinee in lunghe miofibre intatte dal muscolo EDL. Figura 1 mostra un passo dalla rappresentazione grafica del passo &quot;tendine tendine&quot; isolamento. Una volta che il muscolo è completamente digerito, miofibre vengono rilasciati applicando una leggera pressione al muscolo. Figura 2A mostra un quadro rappresentativo di un esperimento di isolamento miofibre dopo il primo lavaggio. A questo punto la cultura contiene una miscela di fasci di miofibre singoli che appaiono come strutture tubolari lunghi e lucenti, iper contratta miofibre, che sono scuri e corti e detriti dal processo di digestione. Alla fine di almeno tre lavaggi consecutivi, solo miofibre singoli vivi devono rimanere nella dish per cultura o analisi a valle (Figura 2B). Figura 2C mostra una fibra lunga e vivo rispetto a una fibra iper contratta (C &#39;). Al momento della separazione, appaiono come cellule satelliti protuberanze piccoli sulla superficie delle miofibre (Figura 3A). Se mantenute in terreno ricco di siero, cellule satelliti attivare, proliferare, migrare e infine fondersi in miotubi (B). Dopo 15 giorni di coltura, tutti i miotubi esprimere il reporter Myf5 YFP (C), suggerendo che la rigenerazione muscolare nell&#39;adulto viene eseguita da cellule che ad un certo punto durante il loro sviluppo aveva espresso il fattore determinante miogenico Myf5. Tutte le cellule satelliti esprimono il fattore di trascrizione associato casella Pax7 17. La linea topo giornalista Pax7Cre-TdTomato può essere usato per tracciare cellule satelliti tramite l&#39;espressione del segnale TdTomato fluorescente (Figure 3D ed E). Figura 4 mostra una immu rappresentantenofluorescence di doppio Pax7 + / cellule satellite MyoD. Classicamente doppia Pax7 + / MyoD + cellule satelliti sono considerati proliferative progenitori muscolari impegnati che o completare il programma di differenziazione verso il basso regolando Pax7 mantenendo un&#39;espressione MyoD o ritorno in quiescenza dal basso regolando MyoD e mantenere Pax7 espressione 18 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Isolamento del muscolo EDL di topo arti posteriori. A. Arti posteriori di un topo adulto 8 settimana fa. Le frecce indicano il distale (ginocchio) e il tendine prossimale (piede) tendine. B. Posizione anatomica del tibiale anteriore (TA) e il muscolo estensore lungo delle dita (EDL) muscolare. C. Tenendo il EDL attraverso il tendine prossimale, il muscolo è tirato verso il ginocchio per esporre il tendine distale. D. Il tendine distale ètagliare e EDL viene rilasciato. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. I risultati rappresentativi di un singolo esperimento di isolamento miofibre. A. Immagine Campo chiaro di un esperimento di isolamento miofibre nella fase primo lavaggio. Freccia rossa indica miofibre dal vivo, freccia bianca indica iper miofibre contratto e freccia gialla indica cellule, miofibre o detriti ECM. B. Dopo lavaggi consecutivi in DMEM, solo miofibre rimangono vivi. C e C &#39;. Immagine rappresenta una lunga intatta vivo miofibre (C) e una iper breve contratta miofibre (C &#39;). Bar 10 micron. Le foto sono state scattate con un microscopio Zeiss Axio Observer Z1 dotato AxioCam HR. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figur<html> e 3. I risultati rappresentativi di un singolo esperimento cultura miofibre. A. Immagine Campo chiaro di un unico, miofibre in tempo reale con la sua cellula satellite corrispondente (freccia) subito dopo l&#39;isolamento (tempo 0). B. Miofibre singole sono state piastrate su Matrigel e coltivate in terreno ricco siero per 15 giorni. Freccia bianca indica miotubi differenziati rispetto a singole cellule (freccia gialla) C. Miofibre singole a partire da un Myf5Cre; topo RosaYFP sono state coltivate come in B. La freccia indica Myf5 miotubi derivati. D e E. Miofibre singoli da Pax7Cre; TdTomato sono state isolate e fissate subito dopo. Le frecce indicano Pax7 cellulare positiva satellite quiescente (E, rosso). I nuclei sono stati colorati con DAPI (D). Bar: 50 micron. Le foto sono state scattate con un microscopio Zeiss Axio Observer Z1 dotato AxioCam HR. modi &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Esempio di colorazione immunofluorescenza delle cellule satelliti su miofibre. Miofibre singoli sono state isolate e coltivate per 72 ore in condizioni di galleggianti. Le cellule satellite su miofibre sono state colorate per il satellite marcatore della cella Pax7 specifico (B, rosso) e il fattore di regolamentazione miogenico MyoD (C, verde). I nuclei sono stati colorati con DAPI (A). Bar: 50 micron. Le foto sono state scattate con un microscopio Zeiss Axio Observer Z1 dotato AxioCam HR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Dissezione muscolare (5 min ogni muscolo) </td><td><ul><li> Tendon all&#39;isolamento tendine </li><li> Strumenti di Sharp </li><li> Danno muscolare Minimal </li></ul></td></tr><tr><td> Muscle Digestione (30-45 min) </td><td><ul><li> Temperaturadelicato </li><li> Evitare overdigestion </li></ul></td></tr><tr><td> Fibra di isolamento </td><td><ul><li> Evitare di manipolazione di fibre </li><li> Eliminare i residui con alcuni lavaggi </li></ul></td></tr><tr><td> Fibra Cultura (fino a 3-4 settimane) </td><td><ul><li> Formato: qualsiasi </li><li> Rivestimento: siero di cavallo, Matrigel </li><li> Media: basale o un&#39;alta concentrazione sierica </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Panoramica del protocollo di isolamento delle miofibre. Isolamento miofibre Il protocollo è costituito da 4 fasi principali. Per ogni passo, il tempo approssimativo e le principali criticità sono discussi. Per una discussione dettagliata di ogni passaggio, fare riferimento al testo del protocollo.

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Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

L&#39;isolamento e la cultura della miofibre è il gold standard<em&gt; In vitro</emSistema&gt; per studiare la transizione delle cellule satelliti attraverso quiescenza, l&#39;attivazione e la differenziazione. Soprattutto, l&#39;unico sistema di coltura miofibre preserva la miofibre / stelo associazione cella, che è un componente essenziale della nicchia delle cellule staminali muscolari.

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

isolation-culture-individual-myofibers-their-satellite-cells-from

Research

JoVE Journal

Biology

62.1K Views.  Ottawa Hospital Research Institute. L'isolamento e la cultura della miofibre è il gold standard In vitro per studiare la transizione delle cellule satelliti attraverso quiescenza, l'attivazione e la differenziazione. Soprattutto, l'unico sistema di coltura miofibre preserva la miofibre / stelo associazione cella, che è un componente essenziale della nicchia delle cellule staminali muscolari.

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Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Ricerca

Biologia

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolamento dei vasi sanguigni derivati ​​da Multipotent precursori del muscolo scheletrico umano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...