Utili discussioni con Isja de Feijter e Matt Baker sono riconosciuti con gratitudine.

1. Sintesi dei sensori <ol><li> Nella sezione seguente forniamo una procedura per la coniugazione di indicatori di pH a dendrimeri PAMAM. Lo stesso protocollo può essere applicato con modifiche minime al dendrimeri ammina-cuscinetto alternativi. 5,17,13,14 dendrimeri e coloranti disponibili in commercio possono essere utilizzati senza ulteriori purificazioni. </li><li> Sciogliere il dendrimer in DMSO anidro (concentrazione finale di 50 micron). Preparare soluzioni 10mM stock di fluoresceina NHS e tetrametil-rodamina-NHS (TMR) in DMSO anidro. </li><li> Aggiungere alla soluzione dendrimero la quantità desiderata di fluoresceina e TMR. Il rapporto molare nella miscela rifletterà la quantità di coloranti caricati sul dendrimero. Tipicamente 1 ml di soluzione G4 dendrimero PAMAM in una provetta viene fatto reagire con 8 eq (40 microlitri) di fluoresceina e 8 eq (40 microlitri) di TMR. Agitare la soluzione a temperatura ambiente per 12 ore. </li><li> Diluire 1:10 con acqua deionizzata e caricare la reazionemiscela in un sacchetto di dialisi (MWCO = 10 kDa). Dializzare per 24 ore contro acqua deionizzata sostituire frequentemente l&#39;acqua nel serbatoio. </li><li> Trasferire la soluzione in un flaconcino e congelare asciugare per 24 ore. Una polvere viola deve essere ottenuta. Peso del solido ottenuto e sciogliere in acqua milliQ ad una concentrazione finale di 10 mM. Aliquota della soluzione e conservare a -20 ° C. </li></ol> 2. In vitro Misurazioni del pH <ol><li> Per in vitro calibrazione preparare una soluzione di 500nm dendrimero in PBS (phosphate 2 mM) in una cuvetta di quarzo. Si raccomanda l&#39;uso di un tampone PBS molto diluite (2 mM) per evitare brusche variazioni di pH durante la titolazione. </li><li> Misurare gli spettri di emissione di fluoresceina (exc 488 nm) e TMR (exc 550 nm) e ottimizzare le impostazioni ottiche del fluorimetro per ottenere un buon rapporto segnale-rumore. </li><li> Eseguire una titolazione pH con l&#39;aggiunta di piccoli volumi di NaOH 0,1 N e HCl 0,1 N. Dopo ogni aggiunta agitare la provettaper la miscelazione, attendere 1 min per equilibrazione e misurare il pH mediante un pH microelettrodo. Spettri di emissione della fluoresceina e TMR deve essere registrato per ogni passo senza alcun cambiamento nelle impostazioni ottiche. </li><li> Tracciare l&#39;intensità di fluorescenza vs pH per la titolazione. Il segnale rhodamine dovrebbe essere influenzata dal pH (&lt;10%). Il segnale fluoresceina dovrebbe essere una curva sigmoidale e dovrebbe essere dotata di un modello single-vincolante con pK = 6.4. </li></ol> 3. Cella cultura e elettroporazione <ol><li> Coltivare cellule HeLa in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino e 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (Invitrogen). Mantenere coltura cellulare a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 nell&#39;atmosfera. </li><li> Per dendrimer elettroporazione, quando le cellule sono confluenti, rimuovere il supporto e lavare le cellule con DPBS (Dulbecco Phosphate-Buffered Saline). Rimuovere il DPBS e aggiungere tripsina-EDTA. Neutralizzare Il Tryppeccato con l&#39;aggiunta di siero mezzo contenente ma non antibiotici. Centrifugare a 900-1.200 rpm per 2 minuti a temperatura ambiente. Togliere la carta e sciacquare il pellet con DPBS. </li><li> Contare le celle e prendere 4 * 10 6 cellule. Centrifugare a 1.200-1.500 rpm per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 200 ml di tampone microporation (fornito dal costruttore microporator) e trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere la soluzione acquosa dendrimero in cellule risospese. La quantità di dendrimero necessaria per campione dipende dal tipo PAMAM (tipicamente 250 nM per cationico e 2 mM per dendrimeri neutri). </li><li> Aggiungere tampone elettroporazione (fornito dal costruttore microporator) in un tubo microporation. Pipettare le cellule ei dendrimeri miscele con elettroporazione punta di 100 volumi di dimensioni microlitri. Inserire la pipetta microporator nella stazione pipetta. Impostare la condizione impulsi per microporation: tensione ad impulsi = 1.005 V; impulso wid° = 35 msec, il numero di impulsi = 2. </li><li> Dopo che le cellule di trasferimento dell&#39;impulso a 1,5 ml provetta e centrifugare le cellule per 5 min a 1200 rpm per rimuovere l&#39;eccesso di dendrimero nel mezzo. Tavola 10 ml di cellule elettroporate da 35 mm piatti con fondo di vetro (WillCo-dish GWSt-3522), con terreno fresco w / o antibiotici. </li></ol> 4. pH Sensing in cellule viventi HeLa <ol><li> Celle di immagine con un microscopio confocale a 12 ore dopo l&#39;elettroporazione. </li><li> Set di filtri standard per fluoresceina e rodamina può essere utilizzato. Se i filtri sintonizzabili sono disponibili set di un canale verde 500-550 nm e un canale rosso da 580 nm a 650 nm. Eccitazione a 488 nm è ottimale per la fluoresceina, mentre rodamina potrebbe essere ripreso sia con il 543nm o la linea laser 561. </li><li> Fuoco il preparato e regolare la potenza laser e rivelatori guadagno per massimizzare il rapporto segnale-rumore. Se l&#39;elettroporazione era cellule successo dovrebbero essere fluorescente brillantemente in entrambi i canali. Illocalizzazione dipende dalla dimensione e carica del dendrimero utilizzato. Spesso alcuni localizzazione lisosomiale (piccole vescicole perinucleari) è presente a causa di endocitosi o compartimentazione. Se la localizzazione lisosomiale è predominante, cioè la maggior parte della fluorescenza è localizzato all&#39;interno di vescicole e segnale debole si osserva nel citosol, ciò significa la tossicità e la misurazione devono essere eliminati. Acquisire sequenzialmente i due canali, se necessario acquisire diverse immagini e media immagini per migliorare la qualità dell&#39;immagine. </li><li> Per morsetto calibrazione pH cellulare utilizzando tamponi con ionofori a diversi pH e acquisire almeno 20 cellule per pH come descritto sopra. Per una descrizione dettagliata della procedura e la composizione dei buffer consultare Bizzarri e colleghi. 16 Si consiglia di misurare almeno 5 punti dal pH = 5,5 a pH = 7.5. pH inferiore a 6 sono tossici per le cellule ma tollerata per un breve lasso di tempo, si consiglia di acquisire le immagini più velocemente possibile. Se le celluledimostrare segni di apoptosi, eliminare le cellule e riavviare. </li><li> Utilizzare ImageJ o software analoghi per l&#39;analisi dei dati. Importare le immagini del canale verde e rosso, sottrarre sfondo e creare un rapporto pixel per pixel delle immagini con lo strumento &quot;Calcolatore di immagine&quot;. </li><li> Prelievo di una regione di interesse (ROI) selezionando la cella desiderata e misurare il rapporto intracellulare verde a rosso. Analizzare tutte le immagini acquisite e quindi tracciare il rapporto rispetto al pH. Nell&#39;intervallo tra 5.5 e 7.5 la tendenza dovrebbe essere lineare. L&#39;adattamento lineare dei punti ottenuti darà la curva di calibrazione che verrà utilizzato per convertire rapporto verde a rosso a pH. </li><li> Come ulteriore controllo acquisire diverse cellule non trattate (senza Ionofori) e provare a calcolare il pH con la curva di calibrazione ottenuta. Un valore compreso tra 7.2 e 7.4 deve essere ottenuta. </li></ol> 5. In Vivo Preparazione del campione <ol><li> Gli esperimenti sono stati eseguiti su C57BL/6J (maschi e femmine) tra postnatale day 28 e 70. Anestetizzato il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di uretano (cioè etil carbammato) (20% w / v in soluzione salina fisiologica, 20 mg / Kg uretano). Gli animali sono stati sacrificati dopo esperimento con una overdose di uretano seguita da una iniezione intracardiaca della stessa anestetico. </li><li> Eseguire una iniezione intramuscolare di desametasone fosfato di sodio (2 mg / kg peso corporeo) per ridurre la risposta allo stress corticale e edema cerebrale durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Radersi la testa dell&#39;animale e applicare 2,5% gel lidocaina al cuoio capelluto. </li><li> Usare le forbici per tagliare il lembo di pelle che ricopre il cranio di entrambi gli emisferi </li><li> Lavare l&#39;osso esposto con soluzione salina e rimuovere delicatamente il periostio con pinze. Ciò fornirà una base migliore per colla e cemento dentale ad aderire con. </li><li> Applicare un acciaio palo di testa su misura con una camera di imaging centrale e incollare con cianoacrilato in un piano approssimativamente parallelo con il cranio sulla regione corticale di interest e fissarlo in posizione con cemento dentale bianco (Paladur). </li><li> Fissare la testa del mouse per eseguire una craniotomia di 2-3 mm di diametro forato sopra la regione di interesse. </li><li> Cercare di minimizzare il riscaldamento della corteccia durante l&#39;intervento chirurgico, lacerazioni durali, o sanguinamento. </li><li> Mantenere la corteccia superfuse con ACSF sterile (126 mM NaCl, KCl 3 mM, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1.3 MgSO mm 4, 26 NaHCO mm 3, 2.4 mM CaCl 2, glucosio 15 mM, 1,2 mM HEPES in H 2 O distillata , pH = 7,4). </li></ol> 6. pH imaging cervello di topo <ol><li> Durante l&#39;animale la respirazione aiuti esperimento fornendo O aria 2 arricchita. L&#39;ossigeno è arricchito fino al 80%. O 2 pressione e flusso parziale è spesso regolati per ottenere un aiuto alla respirazione corretta. Mantenere costante la temperatura corporea a 37 ° C con una valutazione riscaldamento centralizzato coperta. </li><li> Fissare l&#39;animale attraverso il palo di acciaio sotto l&#39;obiettivo di una due-fotoinstallazione n imaging. </li><li> Per iniettare il sensore nella corteccia cerebrale caricare una pipetta di vetro contenente un elettrodo AgCl (diametro consigliato 4 mm) con la soluzione dendrimero (1 mM). L&#39;elettrodo permetterà di registrare potenziali di campo extracellulari. </li><li> Con una configurazione microiniezione inserire la pipetta nella corteccia a circa 150 micron di profondità. Iniettare per 1-2 min ad una pressione di 0,5 psi. </li><li> Ottimizzare la configurazione ottica per l&#39;imaging. Potenza del laser deve essere regolato per minimizzare photobleaching e fotodanneggiamento. Tipicamente potenza del laser impiegato è di circa 20 mW e guadagno PMT è stata mantenuta costante a 667 V in quanto le calibrazioni precedenti hanno dimostrato che questa tensione dà il miglior rapporto S / N. </li><li> Per l&#39;imaging eccitare il sensore a 820 nm e rilevare simultaneamente fluoresceina e rodamina fluorescenza attraverso filtri FITC e TRITC standard. </li><li> Per il tempo le misure risolte acquisiscono serie lasso di tempo a 2 Hz. </li><li> Per la correzione del fondo acquisire cornice scura con il laser otturatore chiuso per misurare il rumore termico medio risultante nei PMT e il piedistallo solitamente aggiunti dall&#39;elettronica. </li><li> Per l&#39;analisi dei dati seguire la stessa procedura riportata nella sezione 4. </li></ol>

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Default: Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi critiche per l&#39;imaging pH con sensori basati dendrimero-sono: i) la selezione del ponteggio dendritica corretta e il numero di indicatori coniugati ad esso e ii) l&#39;ottimizzazione di protocollo di recapito sensore in cellule o in vivo. La procedura di sintesi è abbastanza semplice e può essere applicato praticamente ad ogni polimero hyperbranched ammina-cuscinetto. I sensori possono essere ottenuti da dendrimeri disponibili in commercio e coloranti NHS-attivati ​?...

L&#39;utilizzo di molecole fluorescenti per etichettare specifiche molecole biologicamente rilevanti ha completamente cambiato il nostro modo di studiare sistemi biologici. Widefield e microscopia confocale consentito in tempo reale ad alta risoluzione visualizzazione dei processi biologici e oggi sono tra le tecniche più popolari per studiare eventi biologici in vitro, in cellule e in vivo. 1 un miglioramento rilevante era rappresentata dallo sviluppo di indicatori di fluorescenza , cioè coloranti cui fluorescenza dipende dalla concentrazione di una entità molecolare specifico. pH e calcio indicatori, in particolare, hanno avuto un impatto drammatico sullo studio della fisiologia cellulare a causa della enorme rilevanza di 2 + ioni in biologia H + e Ca. 2,3 Tuttavia, la maggior parte dei coloranti sensibili presenti diversi limiti intrinseci legati alla loro piccola molecola comportamento quali: i) difficoltà targeti subcellulareng; ii) scarsa solubilità in acqua e conseguente scarsa biocompatibilità;. e iii) perdite cellulare e quindi la mancanza di capacità time-lapse imaging lungo 4 Inoltre, il segnale di molte sonde può non essere corretta per la dipendenza dalla concentrazione di colorante (non- l&#39;imaging raziometrico) e quindi, una misura assoluta in cellule o in vivo non è possibile. Recentemente abbiamo descritto un metodo semplice ed efficace per superare queste limitazioni, basato sulla coniugazione di coloranti sensibili alla pressione su un ponteggio dendrimero. 5 dendrimeri sono polimeri hyperbranched monodisperse con proprietà molto interessanti per applicazioni biologiche. 6 In particolare diverse architetture dendritiche sono stati sviluppati e utilizzati per la droga 7 e la consegna del gene. 8 Solo molto recentemente alcuni gruppi hanno cominciato a esplorare le potenzialità di queste molecole come impalcatura per i dispositivi di rilevamento. 9,10,11 Abbiamo precedentementedescritto una via sintetica semplice verso la funzionalizzazione di diversa polyamidoamine (PAMAM) scaffold a base di esteri NHS-attivati. Coniugati 12 possono essere ottenuti in un unico passaggio mediante dialisi come soltanto la purificazione. È interessante notare che questo approccio può essere facilmente applicata ad una varietà di scaffold dendritiche o polimerici. 13,14 Per raggiungere dendrimeri di imaging raziometrici erano doppio marcato con due serie di coloranti: i) un indicatore di pH (cioè fluoresceina) e ii) una porzione fluorescente pH-indipendente (cioè rodamina). Questo ha permesso di effettuare l&#39;imaging pH accurate come rapporto tra fluoresceina e rodamina dipende solo dal pH e non più sulla concentrazione della sonda. Un altro approccio interessante per questo problema è rappresentata dall&#39;utilizzo di sonde a vita basata. 15 Come la vita non dipende concentrazione sonda queste misurazioni non necessitano di correzione raziometrico. Tuttavia, LIFmisure Etime richiedono una più complessa configurazione strumentale e la loro risoluzione temporale è sub-ottimale per i processi fisiologici veloci, limitando così le loro potenziali applicazioni. Al fine di effettuare l&#39;imaging intracellulare, la sonda deve essere consegnato attraverso la membrana plasmatica nel citosol. Poiché i dendrimeri non vengono membrana permeabile causa delle loro dimensioni e idrofilia, consegna intracellulare potrebbe avvenire tramite elettroporazione. Mediante questa tecnica, ampiamente utilizzata in biologia per la trasfezione, macromolecole etichettati possono essere efficacemente consegnati in cellule effettuare immagini di alta qualità. Inoltre, con elettroporazione le complicazioni legate al dendrimero endocitosi possono essere evitate le macromolecole sono direttamente consegnati al citoplasma. È interessante notare che dopo l&#39;elettroporazione diversi dendrimeri mostra localizzazioni distinte all&#39;interno delle cellule anche in assenza di qualsiasi sequenza di targeting specifico. 5 Questo passivoe rivolti, solo a causa delle proprietà fisico-chimiche del dendrimero, può essere sfruttata per realizzare specifici organello pH imaging. Immagini Raziometrico può essere effettuata utilizzando la microscopia confocale. Fluoresceina e rodamina, covalentemente coniugato con l&#39;impalcatura dendritica, sono stati ripresi separatamente e un pixel per pixel rapporto mappa è stata creata. Sono stati segnalati diversi procedure di controllo di pH intracellulare in cellule viventi mediante ionofori. Ionofori sono piccole molecole idrofobiche in grado di trasportare ioni attraverso la membrana plasmatica; Ionofori per ione H +, come nigericin, sono disponibili e possono essere usati per calibrare sensori basati dendrimero-16 Queste misurazioni hanno rivelato una risposta lineare a pH analogamente a quanto osservato. in vitro. Sulla base del pH intracellulare calibrazione potrebbe essere misurata con precisione. Queste misure hanno dimostrato che il sensore basato dendrimer, può essere uno strumento prezioso per lo studio H + homeostAsis nelle cellule viventi e dei processi patologici che coinvolgono pH regolazione malfunzionamenti. Abbiamo recentemente dimostrato che i sensori di pH basato dendrimero possono essere applicate anche in vivo, eseguendo l&#39;imaging pH nel cervello di topi anestetizzati. 17 causa dell&#39;ambiente complesso di tessuti viventi una qualità elevata rilevamento vivo è tecnicamente difficile. Qui vi mostriamo una descrizione dettagliata della procedura sperimentale in vivo pH di imaging con enfasi delle questioni cruciali da affrontare per eseguire un accurato immagini pH nel cervello. Microscopia a due fotoni è stato impiegato per due motivi principali: i) l&#39;uso di luce infrarossa permette di superare la mancanza di penetrazione nei tessuti della microscopia confocale norma; ii) l&#39;ampio assorbimento a due fotoni di fluoresceina e rodamina consentire la loro eccitazione simultanea evitando l&#39; complicanze legate all&#39;uso di due lunghezze d&#39;onda di eccitazione. misure di pH nel cervello di topo sono statieffettuate con successo; sensori prontamente rispondono all&#39;ipossia provocare cambiamenti di pH nello spazio extracellulare cervello. Queste misurazioni mostrano che gli indicatori basato dendrimero possono essere usati con successo per evidenziare cambiamenti fisiologici e patologici del pH in vivo in un modello animale.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
		 <td>Company</td>
		 <td>Catalogue number</td>
		 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
	 <tr>
	 <td>PAMAM G4</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>412449</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Carboxyfluorescein NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1311</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>TMR NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1171</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>DMSO</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>D8418</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Dyalsis bags</td>
		 <td>Spectrum Labs</td>
		 <td>132117</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>WillCo Dishes</td>
		 <td>WillCo Wells</td>
		 <td>GWSt-3512</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Urethane</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>U2500</td>
		 <td></td>
	 </tr>
 </tbody>
</table>

synthesis, cellular delivery and in vivo application of dendrimer-based ph sensors

Lo sviluppo di indicatori fluorescenti ha rappresentato una rivoluzione per le scienze della vita. Geneticamente codificato e fluorofori sintetici con capacità di rilevamento ha permesso la visualizzazione di specie biologicamente rilevanti con alta risoluzione spaziale e temporale. Coloranti sintetici sono di particolare interesse grazie alla loro elevata sintonizzabilità e la vasta gamma di analiti misurabili. Tuttavia, queste molecole soffrono di alcune limitazioni legate alla piccola comportamento della molecola (scarsa solubilità, difficoltà di targeting, spesso senza immagini ratiometric consentito). In questo lavoro si introduce lo sviluppo di sensori basati dendrimero e presentiamo una procedura per la misurazione del pH in vitro, in cellule viventi e in vivo. Abbiamo scelto dendrimeri come piattaforma ideale per i nostri sensori per le loro numerose proprietà desiderabili (monodispersity, proprietà sintonizzabili, multivalenza) che li un&#39;impalcatura ampiamente utilizzato per diversi dispositivi biomedici fatte. La coniugazione di pH fluorescenteIndicatori al patibolo dendrimer portato ad un miglioramento delle loro prestazioni di rilevamento. In particolare dendrimeri mostre ridotto la perdita delle cellule, migliore il targeting intracellulare e permettere misurazioni raziometriche. Questi nuovi sensori sono stati impiegati con successo per misurare il pH nel vivere cellule HeLa e in vivo nel cervello di topo.

La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica della coniugazione di rilevamento coloranti differenti scaffold dendritiche. Gli indicatori risultanti possono essere ottenuti in un solo passo sintetica facile da prodotti commercialmente disponibili. Dendrimeri ammina cuscinetti vengono fatti reagire con coloranti NHS attivati ​​in DMSO e purificati mediante dialisi. Tale procedura generale è già stato utilizzato con successo per l&#39;etichettatura di alcuni dendrimeri: i) generazione PAMAM den...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

I sensori di fluorescenza sono strumenti potenti nella scienza della vita. Qui si descrive un metodo per sintetizzare ed utilizzare sensori fluorescenti basato dendrimero-per misurare il pH nelle cellule viventi e in vivo. L&#39;impalcatura dendritiche esalta le proprietà dei coloranti fluorescenti coniugati che conducono al miglioramento delle caratteristiche di rilevamento.

Sintesi, Consegna Cellulare e<em&gt; In vivo</em&gt; Applicazione di sensori di pH basati Dendrimero

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Unit 1

Acid–Base Titration

Acid-base and Solubility Equilibria

SCIENTISTS IN ACTION

11.6K Views.  Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR.  I sensori di fluorescenza sono strumenti potenti nella scienza della vita. Qui si descrive un metodo per sintetizzare ed utilizzare sensori fluorescenti basato dendrimero-per misurare il pH nelle cellule viventi e in vivo. L'impalcatura dendritiche esalta le proprietà dei coloranti fluorescenti coniugati che conducono al miglioramento delle caratteristiche di rilevamento. 

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Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent reactions with azides to form cyanocarbene intermediates. The synthesis of hypervalent iodonium alkynyl triflates can be facile, but difficulties stem from their isolation and reactivity. In particular, the necessity to use filtration under inert atmosphere at -45 &deg;C for some HIATs requires special care and equipment. Once isolated, the compounds can be stored and used in reactions with azides to form cyanocarbene intermediates. 
The evidence for cyanocarbene generation is shown by visible extrusion of dinitrogen as well as the characterization of products that occur from O-H insertion, sulfoxide complexation, and cyclopropanation. A side reaction of the cyanocarbene formation is the generation of a vinylidene-carbene and the conditions to control this process are discussed. There is also potential to form a hypervalent iodonium alkenyl triflate and the means of isolation and control of its generation are provided. The O-H insertion reaction involves using a HIAT, sodium azide or tetrabutylammonium azide, and methanol as solvent/substrate. The sulfoxide complexation reaction uses a HIAT, sodium azide or tetrabutylammonium azide, and dimethyl sulfoxide as solvent. The cyclopropanations can be performed with or without the use of solvent. The azide source must be tetrabutylammonium azide and the substrate shown is styrene.

Herein is described the synthesis, isolation, and reactions of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) with azides to generate cyanocarbenes. The procedures will involve air-sensitive and cryogen techniques, including cold filtration under an inert atmosphere. Handling and safety of the synthesized compounds will also be discussed.

Sintesi di hypervalent iodonio Alchinile triflati per l&#39;applicazione di Generazione Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

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Chimica

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended solvent window, low background currents, corrosion resistance, etc., arise from the catalytically inert nature of the surface. However, if during the growth process, non-diamond-carbon (NDC) becomes incorporated into the electrode matrix, the electrochemical properties will change as the surface becomes more catalytically active. As such it is important that the electrochemist is aware of the quality and resulting key electrochemical properties of the BDD electrode prior to use. This paper describes a series of characterization steps, including Raman microscopy, capacitance, solvent window and redox electrochemistry, to ascertain whether the BDD electrode contains negligible NDC i.e. negligible sp2 carbon. One application is highlighted which takes advantage of the catalytically inert and corrosion resistant nature of an NDC-free surface i.e. stable and quantifiable local proton and hydroxide production due to water electrolysis at a BDD electrode. An approach to measuring the local pH change induced by water electrolysis using iridium oxide coated BDD electrodes is also described in detail.

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

A protocol is described for the characterization of the key electrochemical parameters of a boron doped diamond (BDD) electrode and subsequent application for in situ pH generation experiments.

Valutazione del Boro Doped Diamante elettrodi Qualità e applicazioni per<em&gt; In Situ</em&gt; Modifica del pH locale da acqua Elettrolisi

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended ...

Synthesis and Exfoliation of Discotic Zirconium Phosphates to Obtain Colloidal Liquid Crystals

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and engineers. Growth of such anisotropic nanocrystals through a simple chemical method is a challenging task. In this study, we fabricate discotic nanodisks of zirconium phosphate [Zr(HPO4)2&#183;H2O] as a model material using hydrothermal, reflux and microwave-assisted methods. Growth of crystals is controlled by duration time, temperature, and concentration of reacting species. The novelty of the adopted methods is that discotic crystals of size ranging from hundred nanometers to few micrometers can be obtained while keeping the polydispersity well within control. The layered discotic crystals are converted to monolayers by exfoliation with tetra-(n)-butyl ammonium hydroxide [(C4H9)4NOH, TBAOH]. Exfoliated disks show isotropic and nematic liquid crystal phases. Size and polydispersity of disk suspensions is highly important in deciding their phase behavior.

A two dimensional model material of discotic zirconium phosphate was developed. The inorganic crystal with lamellar structure was synthesized by hydrothermal, reflux, and microwave-assisted methods. On exfoliation with organic molecules, layered crystals can be converted to monolayers, and nematic liquid crystal phase was formed at sufficient concentration of monolayers.

Sintesi ed esfoliazione della discotici zirconio Fosfati di ottenere cristalli liquidi colloidale

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI). Their purpose is to enhance the relaxation rate of water protons in tissue, thus increasing the MR image contrast and the specificity of the MRI measurements. Current clinically approved contrast agents are low molecular weight molecules that are rapidly cleared from the body. The use of dendrimers as carriers of paramagnetic chelators can play an important role in the future development of more efficient MRI contrast agents. Specifically, the increase in local concentration of the paramagnetic species results in a higher signal contrast. Furthermore, this CA provides a longer tissue retention time due to its high molecular weight and size. Here, we demonstrate a convenient procedure for the preparation of macromolecular MRI contrast agents based on poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers with monomacrocyclic DOTA-type chelators (DOTA &#8211; 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate). The chelating unit was appended by exploiting the reactivity of the isothiocyanate (NCS) group towards the amine surface groups of the PAMAM dendrimer to form thiourea bridges. Dendrimeric products were purified and analyzed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry, and elemental analysis. Finally, high resolution MR images were recorded and the signal contrasts obtained from the prepared dendrimeric and the commercially available monomeric agents were compared.

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

This protocol describes the preparation and characterization of a dendrimeric magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent that carries cyclen-based macrocyclic chelates coordinating paramagnetic gadolinium ions. In a series of MRI experiments in vitro, this agent produced an amplified MRI signal when compared to the commercially available monomeric analogue.

Preparazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caratterizzazione del dendrimero a base di agenti di contrasto per risonanza magnetica

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical properties, which allow for the absorption of near-infrared (NIR) light and can subsequently convert it into multiplexed emissions that span over a broad range of regions from the UV to the visible to the NIR. This article presents detailed experimental procedures for high-temperature co-precipitation synthesis of core-shell UCNs that incorporate different lanthanide ions into nanocrystals for efficiently converting deep-tissue penetrable NIR excitation (808 nm) into a strong blue emission at 480 nm. By controlling the surface modification with biocompatible polymer (polyacrylic acid, PAA), the as-prepared UCNs acquires great solubility in buffer solutions. The hydrophilic nanocrystals are further functionalized with specific ligands (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) for localization on the cell membrane. Upon NIR light (808 nm) irradiation, the upconverted blue emission can effectively activate the light-gated channel protein on the cell membrane and specifically regulate the cation (e.g., Ca2+) influx in the cytoplasm. This protocol provides a feasible methodology for the synthesis of core-shell lanthanide-doped UCNs and subsequent biocompatible surface modification for further cellular applications.

A protocol is presented for the synthesis of core-shell lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) and their cellular applications for channel protein regulation upon near-infrared (NIR) light illumination.

Sintesi di nanocristalli di Upconversion drogato con lantanidi Core-shell per applicazioni cellulari

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various precursor noble metal ions with reducing agents in a 1:1 (v/v) ratio results in the formation of metal gels within seconds to minutes compared to much longer synthesis times for other techniques such as sol-gel. Conducting the reduction step in a microcentrifuge tube or small volume conical tube facilitates a proposed nucleation, growth, densification, fusion, equilibration model for gel formation, with final gel geometry smaller than the initial reaction volume. This method takes advantage of the vigorous hydrogen gas evolution as a by-product of the reduction step, and as a consequence of reagent concentrations. The solvent accessible specific surface area is determined with both electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry. After rinsing and freeze drying, the resulting aerogel structure is examined with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, and nitrogen gas adsorption. The synthesis method and characterization techniques result in a close correspondence of aerogel ligament sizes. This synthesis method for noble metal aerogels demonstrates that high specific surface area monoliths may be achieved with a rapid and direct reduction approach.

A rapid, direct solution-based reduction synthesis method to obtain Au, Pd, and Pt aerogels is presented.

Un metodo di sintesi rapida per Au, Pd e Pt Aerogels tramite riduzione diretta basata su soluzione

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Synthesis of Soft Polysiloxane-urea Elastomers for Intraocular Lens Application

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses (a-IOLs). Aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes (PDMS) were previously prepared via the ring-chain equilibration of the cyclic siloxane octamethylcyclotetrasiloxane (D4) and 1,3-bis(3-aminopropyl)-tetramethyldisiloxane (APTMDS). Phenyl groups were introduced into the siloxane backbone via the copolymerization of D4 and 2,4,6,8-tetramethyl-2,4,6,8-tetraphenyl-cyclotetrasiloxane (D4Me,Ph). These polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers were synthesized for increasing the refractive indices of polysiloxanes. For applications as an a-IOL, the refractive index of the polysiloxanes must be equivalent to that of a young human eye lens. The polysiloxane molecular weight is controlled by the ratio of the cyclic siloxane to the endblocker APTMDS. The transparency of the PSU elastomers is examined by the transmittance measurement of films between 200 and 750 nm, using a UV-Vis spectrophotometer. Transmittance values at 750 nm (upper end of the visible spectrum) are plotted against the PDMS molecular weight, and &#62; 90% of the transmittance is observed until a molecular weight of 18,000 g&#183;mol&#8722;1. Mechanical properties of the PSU elastomers are investigated using stress-strain tests on die-cut dog-bone-shaped specimens. For evaluating mechanical stability, mechanical hysteresis is measured by repeatedly stretching (10x) the specimens to 5% and 100% elongation. Hysteresis considerably decreases with the increase in the PDMS molecular weight. In vitro cytotoxicity of some selected PSU elastomers is evaluated using an MTS cell viability assay. The methods described herein permit the synthesis of a soft, transparent, and noncytotoxic PSU elastomer with a refractive index approximately equal to that of a young human eye lens.

This study describes synthetic routes for aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes and polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers and for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers. It presents the application of PSUs as accommodating an intraocular lens. An evaluation method for in vitro cytotoxicity is also described.

Sintesi degli elastomeri molli polisilossano-urea per applicazione di lente intraoculare

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the designing of poly(ethylenimine) grafted with polyethylene glycol (PEI-g-PEG) copolymer functionalized gold nanoparticles (AuNPs) with loaded aptamer (AS1411) and DOX through amide reactions. AS1411 is specifically bonded with targeted nucleolin receptors on cancer cells so that DOX targets cancer cells instead of healthy cells. First, PEG is carboxylated, then grafted to branched PEI to obtain a PEI-g-PEG copolymer, which is confirmed by 1H NMR analysis. Next, PEI-g-PEG copolymer coated gold nanoparticles (PEI-g-PEG@AuNPs) are synthesized, and DOX and AS1411 are covalently bonded to AuNPs gradually via amide reactions. The diameter of the prepared AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs is ~39.9 nm, with a zeta potential of -29.3 mV, indicating that the nanoparticles are stable in water and cell medium. Cell cytotoxicity assays show that the newly designed DOX loaded AuNPs are able to kill cancer cells (A549). This synthesis demonstrates the delicate arrangement of PEI-g-PEG copolymers, aptamers, and DOX on AuNPs that are achieved by sequential amide reactions. Such aptamer-PEI-g-PEG functionalized AuNPs provide a promising platform for targeted drug delivery in cancer therapy.

In this protocol, doxorubicin-loaded AS1411-g-PEI-g-PEG modified gold nanoparticles are synthesized via three-step amide reactions. Then, doxorubicin is loaded and delivered to target cancer cells for cancer therapy.

Sintesi di Nanoparticelle d'oro modificate Aptamer-PEI-g-PEG Caricate con doxorubicina per la consegna mirata di farmaci

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...