Gli autori ringraziano il Dr. Kent Seeley, direttore del Centro per la Drug Discovery e l&#39;innovazione (CDDI) Proteomica Nucleo Strutture presso University of South Florida, per l&#39;uso di questo strumento. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCD concessione R01 DC004295 a BHAS

Dichiarazione Etica Esperimenti con topi di tessuto sono stati approvati dalla University of South Florida Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa (protocolli 3931R, 3482R), come previsto in base alle direttive del National Institutes of Health. 1. Estrazione Protein <ol><li> Isolare cocleare epitelio sensoriale da 16 a 30 giorni di età (P30) CBA / J topi e conservare a -80 ° C. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, lavare tessuti con 500 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS). Centrifugare per 3 minuti a 1000 xg, e rimuovere il surnatante. Ripetere per un totale di tre lavaggi. </li><li> Tessuto ultrasuoni per 30 secondi su ghiaccio in 100 ml di tampone di lisi contenente 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 ug / AEBSF ml, 10 mg / ml leupeptina, 100 pg / ml pepstatina, 2 mg / ml aprotinina, e 0,5 mg / ml microcistina utilizzando un dismembrator sonico (Modello 100, Thermo Fisher). Raffreddare lisato su ghiaccioper 1 min tra ogni sonicazione. Sonicare un totale di 3x. </li><li> Centrifugare l&#39;estratto a 750 xga 4 ° C per 2 minuti e rimuovere il surnatante in una nuova provetta. Estrarre il pellet in 50 ml di tampone di lisi per sonicazione per 30 secondi su ghiaccio. Centrifugare l&#39;estratto a 750 xga 4 ° C per 2 min. Combinare entrambi i lisati e centrifugare a 28.600 xg a 4 ° C per 60 min. Rimuovere il surnatante in una nuova provetta e aggiungere 20 microlitri di tampone di lisi contenente 0,1% ASB-14 al pellet. Vortex per 1 min e incubare per 60 min a 4 ° C. </li><li> Riscaldare il campione a 95 ° C per 5 minuti, poi raffreddare a 4 ° C per 60 min. Seguire con centrifugazione a 16.000 xg a 25 ° C per 10 min. Raccogliere il surnatante e trasferire in un nuovo tubo. </li><li> Centrifugare la sospensione a 16.000 xga 4 ° C per 5 min e conservare il surnatante per la digestione. </li></ol> 2. Doppia Trittico digestione delle proteine ​​di Whole lisato Uso FASP <ol><li> Aggiungere a 30 μl aliquota (≤ 400 mg) di estratto proteico cocleare, contenente 4% di sodio dodecil solfato (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 e 0,1 M ditiotreitolo (DTT) direttamente ad un filtro rotativo 30K e mescolare con 200 ml di 8 M urea in Tris-HCl. Centrifugare a 14000 g per 15 min. </li><li> Diluire il concentrato con 200 ml di soluzione 8 M urea e centrifugare a 14000 xg per 15 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di 10x iodoacetamide (IAA) in soluzione 8 M urea al concentrato nel filtro e vortex per 1 min. Incubare il filtro rotativo per 20 min a temperatura ambiente (RT) al buio seguita da centrifugazione a 14.000 xg per 10 min. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione 8 M urea al concentrato sul gruppo filtro e centrifugare a 14000 xg per 15 min. Ripetere questo passaggio 2x. Aggiungere 100 pl di 50 mM di bicarbonato di ammonio soluzione (ABC) per l&#39;unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 2x. </li><li> Aggiungere 0,4 mg / mL di tripsina a 1:100 (w / w), enzima-to-Proteina rapporto e incubare una notte (O / N) a 37 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 40 ml di soluzione 50 mM ABC filtrare unità e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M di NaCl al filtro rotativo e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi triptici ad una nuova provetta e acidificare con acido formico (FA) 1,0% per fermare la digestione. </li><li> Lavare il filtro con 40 ml di 8 M urea, e poi lavare 2x con 40 microlitri 18 mW acqua. </li><li> Lavare 3x l&#39;unità filtro con 100 ml di soluzione 50 mM ABC. Dopo l&#39;ultimo lavaggio aggiungere 0,4 mg / mL di tripsina a 1:100 (w / w) rapporto enzima-to-proteina e incubare O / N a 37 ° C. </li><li> Eluire peptidi triptici dal secondo digest aggiungendo 40 ml di soluzione 50 mM ABC all&#39;unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M di NaCl alunità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi triptici ad una nuova provetta e acidificare con FA 1,0%. </li><li> I campioni possono essere quantificati utilizzando il saggio colorimetrico per micropiastre con BSA come standard. </li></ol> 3. Endoproteinase lysC e Trittico digestione delle proteine ​​di Whole lisato Uso FASP <ol><li> Aggiungere una aliquota di 30 microlitri (≤ 400 mg) di estratto proteico cocleare contenente 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 e 0,1 M DTT direttamente ad un filtro rotativo 30K e mescolare con 200 ml di urea 8 M in Tris-HCl . Centrifugare a 14000 g per 15 min. </li><li> Diluire il concentrato con 200 ml di soluzione 8 M urea e centrifugare a 14000 xg per 15 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di 10x IAA in soluzione 8 M urea al concentrato nel filtro e vortex per 1 min. Incubare il filtro rotativo per 20 min a temperatura ambiente al buio quindi si centrifuga a 14000 xg per 10 min. </li><li> Aggiungere 100 ml di 8 M urea solution al concentrato sul gruppo filtro e centrifugare a 14000 xg per 15 min. Ripetere questo passaggio 2x. Aggiungere 100 ml di soluzione 100 mM ABC all&#39;unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 2x. </li><li> Aggiungere 0,1 mg / mL di endoproteinase lysC in 1:50 (w / w) rapporto enzima-to-proteina e incubare O / N a 30 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 40 ml di soluzione 100 mM ABC all&#39;unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M di NaCl al filtro rotativo e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi lysC di una nuova provetta e acidificare con FA 1,0% per fermare la digestione. </li><li> Lavare il filtro con 40 ml di 8 M urea, e poi lavare 2x con 40 microlitri 18 mW acqua. </li><li> Lavare 3x l&#39;unità filtro con 100 ml di soluzione 50 mM ABC. Dopo l&#39;ultimo lavaggio aggiungere 0,4 mg / mL di tripsina in 1:100 enzima-to-prorapporto proteina e incubare O / N a 37 ° C. </li><li> Eluire peptidi triptici aggiungendo 40 ml di soluzione 50 mM ABC all&#39;unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M di NaCl per l&#39;unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi triptici ad una nuova provetta e acidificare con il 1,0% FA. </li><li> Il campione può essere quantificato utilizzando la micropiastra saggio colorimetrico con BSA come standard. </li></ol> 4. Peptidi dissalazione Utilizzo Colonne Spin <ol><li> Attiva una colonna MacroSpin C 18 aggiungendo 500 ml di acetonitrile (ACN) e centrifugare a 1100 xg per 1 min. Gettare il flow-through dopo la centrifugazione. </li><li> Equilibrare la colonna con 500 ml di 0,1% FA e centrifugare a 1100 xg per 1 min. Gettare il flow-through e ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere fino a 500 ml di peptide digerire alla una colonnad centrifugare a 1100 xg per 1 min. Se il volume del campione è superiore a 500 microlitri quindi ripetere questo passaggio. </li><li> Lavare la colonna con 500 ml di 0,1% FA e centrifugare a 1100 xg per 1 min. Gettare il flow-through. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 250 pl di un rapporto di 90:10 ACN-acqua alla colonna e centrifugare a 1100 xg per 1 min. Raccogliere l&#39;eluente contenente i peptidi dissalati e trasferire ad una nuova provetta. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Essiccare il campione peptide dissalato in una centrifuga a vuoto ed evitare di lasciare completamente il campione secco. </li></ol> 5. Scambio ionico Cromatografia <ol><li> Iniettare 50-100 mg di campione proteico digerito su un 200 x 2,1 mm, 5 micron colonna SCX (Polysulfoethyl A) per separare peptidi. </li><li> Utilizzare un gradiente di 2-40% B per 50 min con una portata di 250 ml / min. Solvente A è formiato di ammonio 5 mM, pH 3,0 a 25% di acetonitrile e 75% DDH 2 O. Solvent B è formiato di ammonio 500 mM, pH6,0 nel 25% ACN e il 75% DDH 2 O. </li><li> Monitorare le frazioni peptidiche a 280 nm e raccogliere le frazioni in 2 intervalli di minimo con un collettore di frazioni. </li><li> Frazioni secche in un concentratore di vuoto e risospendere in 500 ml di 50% acetonitrile in DDH 2 O contenente il 5% di FA per aiutare con la rimozione sale. </li><li> Frazioni Redry e conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso per l&#39;analisi nano LC-MS/MS. </li></ol> 6. Acetone Precipitazioni Prima della separazione GELFrEE proteina supernatante cocleare deve essere dissalato. Acetone precipitazione può essere usato per desalinizzare e concentrare proteine. <ol><li> Aggiungere tre volumi di acetone ghiacciato al supernatante cocleare. Vortice delicatamente e incubare a -20 ° CO / N. </li><li> Centrifugare la miscela campione a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare la proteina pellet 3x con acetone freddo e centrifugare a 14000 xg per 5 minuti a 4° C. </li><li> Aria asciugare il pellet e sciogliere in 112 ml di acqua 18 mW. </li><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​utilizzando la micropiastra saggio colorimetrico. </li></ol> 7. GELFrEE Frazionamento di Cochlear sensoriale Epitelio <ol><li> Aggiungere 30 ml di tampone campione 5x (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w / v) di SDS, 50% glicerolo, 0,5% (w / v) di blu di bromofenolo) alla proteina dissalato sospesa in 112 ml di 18 mW acqua. </li><li> Aggiungere 8 ml di 1M DTT e scaldare a 95 ° C per 5 minuti per ridurre legami disolfuro proteici. Dopo il riscaldamento consentire il raffreddamento a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 8 ml di tampone di corsa al serbatoio anodo, 150 ml di tampone di corsa per assaggiare camera di raccolta, e 6 ml di tampone di corsa al serbatoio catodo. </li><li> Rimuovere eventuali buffer che può essere fluito nella camera del campione di caricamento con una pipetta. </li><li> Carico 150 ml (≤ 1 mg) della miscela proteica cocleare, nella camera del campione-carico con un 8% Trè-acetato cartuccia con un intervallo di massa di 3,5-150 kDa. </li><li> Elettrodi inferiori e chiudere il coperchio dello strumento per iniziare la corsa. </li><li> Alla prima pausa sullo strumento aggiungere 2 ml di tampone di corsa al serbatoio catodo e riprendere la corsa. </li><li> Ad ogni intervallo di pausa sullo strumento, raccogliere il campione dalla camera di raccolta del campione con una pipetta e aggiungere a una provetta appena marcato. Lavare i 2x camera di raccolta con 150 ml di tampone di corsa e scartare. </li><li> Aggiungere 150 ml di tampone di corsa fresca alla camera di raccolta del campione e riprendere la corsa. Raccogliere le frazioni proteiche per un periodo di 2,6 ore in un volume totale di 150 microlitri / frazione. </li></ol> 8. 1D elettroforesi su gel di GELFrEE Frazioni Elettroforesi su gel 1D può essere utilizzato per visualizzare i risultati di GELFrEE frazionamento prima digestione enzimatica e analisi MS. GELFrEE frazioni proteiche possono essere separati su un gel Tris-HCl 4-15%. </p&gt; <ol><li> Mescolare un&#39;aliquota di 5 ml di ogni frazione GELFrEE con 5 ml di campione di tampone di diluizione (DTT 350 mM in tampone campione). </li><li> Riscaldare i campioni a 95 ° C per 3 min. </li><li> Campioni Raffreddare a RT. </li><li> Caricare 10 ml di ogni frazione GELFrEE nelle singole corsie del gel e carico di 5 ml di molecolare standard di peso nell&#39;ultimo corsia inutilizzato. </li><li> Attivare il gel a 125 V per 1,5 ore o fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel. </li><li> Rimuovere accuratamente il gel e macchiare con Silver Stain Plus per visualizzare la separazione delle proteine. </li></ol> 9. Digestione delle proteine ​​di frazioni GELFrEE Uso FASP Una procedura FASP modificato viene utilizzato per la rimozione del detersivo e la digestione delle frazioni GELFrEE. <ol><li> Aggiungere le singole frazioni direttamente ad un&#39;unità filtro 30K, mescolare con 200 ml di urea 8 M in Tris-HCl e centrifugare a 14000 xg per 25 min. </li><li> Diluire il concentrato con 200 ml di soluzione di ureae centrifugare a 14.000 xg per 12 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 10 ml di 10x IAA in soluzione di urea al concentrato in ciascuna unità filtro, vortex per 1 min, e incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di soluzione di urea al concentrato sulle unità filtranti e centrifugare a 14.000 xg per 15 min. Ripetere questo passaggio 2x. Aggiungere 100 ml di soluzione 100 mM ABC alle unità filtranti e centrifugare a 14.000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 2x. </li><li> Aggiungere 0,1 mg / mL di lysC per 1:50 (w / w) rapporto enzima-to-proteina alle unità filtra e incubare O / N a 30 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 40 ml di soluzione 100 mM ABC ai filtri spin e centrifugare a 14.000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M NaCl ai filtri spin e centrifugare a 14.000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi lysC da ogni filtro di selezione per una nuova provetta e acidificare con trifluoroacL&#39;acido ETIC (TFA). </li><li> Lavare i filtri di spin con 40 ml di 8 M urea, quindi lavare 2x con 40 microlitri 18 mW acqua. </li><li> Lavare i filtri di spin 3x con 100 ml di soluzione di ABC 50 mm. Dopo l&#39;ultimo lavaggio aggiungere 0,4 mg / mL di tripsina in un 1:100 (w / w) rapporto enzima-to-proteina e incubare O / N a 37 ° C. </li><li> Eluire peptidi triptici da ciascuna unità filtro aggiungendo 40 ml di soluzione 50 mM ABC e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M NaCl alle unità filtranti e centrifugare a 14.000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi triptici da ciascuna unità filtro a una nuova provetta e acidificare con TFA. </li><li> Asciugare tutte le digerisce in un concentratore sotto vuoto. </li></ol> 10. Preparazione del campione per LC-MS/MS <ol><li> LysC Ricostituire secca e peptide trittico digerisce frazioni in 20 microlitri di 0.1% FA e vortex. </li><li> Centrifugare i campioni a 20.000 xg per 10min e rimuovere la parte superiore 95% del campione in un flaconcino campione. </li><li> Iniettare 5 ml di ogni frazione peptidica su una trappola 100 um x 25 mm campione per rimuovere i sali e contaminanti ed eseguire la separazione cromatografica su 75 micron × 10 cm C 18 colonna. </li><li> Utilizzare un gradiente di 2-40% B per 100 min con una portata di 200 Nl / min. Solvente A è 95% ddH2O e 5% acetonitrile contenente 0,1% FA. Solvent B è 80% ACN e 20% ddH2O contenente 0,1% di FA. </li><li> Raccogliere dieci spettri di massa tandem per ogni MS scansione su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. Uno spettrometro di massa LTQ Orbitrap è stato utilizzato in questo esperimento. </li></ol> 11. Protein Identification <ol><li> Identificare le proteine ​​che utilizza il database del mouse UniProt contenente sia avanti e indietro sequenze proteiche e contaminanti comuni. Software MaxQuant con motore di ricerca MASCOT viene utilizzato per effettuare ricerche nel database proteina. </li><li> I parametri di ricerca che possono essere utilizzati comprendono; modific fissozione di carbamidomethyl di cisteina, modifiche variabili di ossidazione della metionina, proteina N-terminale acetilazione, massimo 2 mancati scissione. La lunghezza minima peptide da considerare per l&#39;identificazione a 6 aminoacidi. Inserire una massa errore concentrazione del peptide di ± 8 ppm e una tolleranza massa frammento di 1.2 Da (errore di massa dipende dalla spettrometro di massa utilizzato). </li><li> Nel software MaxQuant, utilizzare un falso tasso di scoperta 1% (FDR) per peptidi e proteine ​​identificazione. Identificazione delle proteine ​​è elencato con il numero di peptidi corrispondenti, la copertura della sequenza cento di proteine, e le sequenze peptidiche. </li></ol>

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R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).</li><li>Darville, L. N., Sokolowski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Proteomic+Analysis+of+Mouse+Cochlear+Sensory+Epithelium+by+Mass+Spectrometry.">In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).</li><li>Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PRoteomics+IDEntifications+(PRIDE)+database+and+associated+tools:+status+in+2013.">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.

<html> I passaggi chiave per massimizzare l&#39;identificazione delle proteine ​​dalla epitelio sensoriale cocleare sono: 1) utilizzo di più endoproteinases per la digestione, 2) utilizzo di più tecniche di separazione, e 3) l&#39;utilizzo di uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. L&#39;applicazione di più enzimi aumenta il numero di peptidi e migliora la copertura sequenza proteica, consentendo così di migliorare il numero di proteine ​​identificate dal tessuto cocleare. Tripsina, la proteasi più ut...

Proteomica è lo studio di sistemi biologici complessi analizzando l&#39;espressione della proteina, la funzione, modifiche e interazioni 1. Diversi metodi sono stati utilizzati per l&#39;analisi del proteoma dell&#39;orecchio interno, compresi anticorpo microarray 2, gel elettroforesi bidimensionale 3-5, e DIGE 6. Tuttavia, solo un numero limitato di proteine ​​sono state identificate e caratterizzate 2,7-10, rispetto agli oltre 10.000 geni e tag di sequenze espresse (EST) identificati nell&#39;orecchio interno 11,12, MS è la tecnica più utilizzata completo e in proteomica per la caratterizzazione delle proteine. Analisi di campioni di proteomica complesse, come la coclea, può essere difficile. Tuttavia, la combinazione di più tecniche di separazione con MS consente l&#39;identificazione di un maggior numero di peptidi e proteine, a causa di una gamma dinamica aumentata concentrazione e capacità di punta 13. Cromatografia multidimensionalePHY riduce miscele di proteine ​​altamente complesse, consentendo l&#39;uso di differenti meccanismi di adsorbimento. Ci sono due approcci comunemente usati MS analisi del proteoma, fucile e proteomica bottom-up. In proteomica fucile, una miscela di proteine ​​intatte viene digerito enzimaticamente e separati mediante cromatografia multidimensionale con forte cromatografia a scambio cationico (SCX) seguita da cromatografia liquida a fase inversa (RPLC) 14,15. I peptidi separati sono sottoposti a tandem MS e database di ricerca 15. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che migliaia di proteine ​​possono essere identificati in una singola analisi e la tecnica è più adatto a proteine ​​di membrana. Nell&#39;approccio bottom-up, miscela proteica è separato, di solito da una o elettroforesi bidimensionale, e le singole bande proteiche o macchie, ritagliare e digerito con un enzima come la tripsina, solitamente con conseguente più peptidi. Tuttavia, un altro più recentely ha sviluppato l&#39;approccio elettroforetico, utilizzato in proteomica bottom-up, è GELFrEE. Questa tecnica fraziona campioni di proteine ​​in fase liquida e li rende meno complessa prima dell&#39;analisi. Questa tecnica è riproducibile, offre elevato recupero di proteine, e riduce la distribuzione delle alte proteine ​​abbondanti in campioni di proteine ​​complesse 16. Peptidi, derivanti da proteine ​​separate, sono analizzati da MS, utilizzando peptide mass fingerprinting o tandem MS (MS / MS), di creare tag di sequenza per database di ricerca 17-19. Alcuni dei principali vantaggi di utilizzare un approccio bottom-up sono la capacità di ottenere separazioni ad alta risoluzione e la copertura completa di proteine. Proteomica bottom-up è la tecnica più utilizzata in proteomica 20, quindi, diversi strumenti di bioinformatica sono disponibili. Inoltre, le proteine ​​possono essere separate in una miscela complessa prima di digestione, per cui vi è una maggiore possibilità di identificazione. Una delle principali sfideutilizzando l&#39;orecchio interno per l&#39;analisi proteomica è la sua piccola dimensione, accessibilità limitato e tipo di cellula diversità 21. Inoltre, le proteine ​​chiave che contraddistinguono la sua funzionalità, come i canali ionici, trasportatori e recettori sono proteine ​​di membrana, che possono essere difficili da isolare 22. Così, la preparazione del campione filtro assistita (FASP) è vantaggioso per le analisi proteomica di tessuti che sono limitati per l&#39;estrazione di proteine ​​e che richiedono detergenti per solubilizzare le membrane 23. Questo filtro permette l&#39;analisi MS di membrana e proteine ​​solubili e per la capacità di isolare peptidi da contaminanti a basso peso molecolare 23,24. Il presente protocollo descrive approcci di proteomica comunemente usati che vengono combinati e modificati per analizzare le proteine ​​solubili e di membrana e per massimizzare il numero di ID della proteina dall&#39;epitelio sensoriale cocleare. Descriveremo utilizzando la proteomica fucile con FASP multi-digestione, cromatografia a scambio ionico, alta risoluzione MS, e l&#39;analisi dei dati. Inoltre, descriveremo proteomica bottom-up con GELFrEE, FASP multi-digestione, alta risoluzione MS, e l&#39;analisi dei dati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

La proteomica è un approccio comunemente usato che può fornire intuizioni in sistemi biologici complessi. L&#39;epitelio sensoriale cocleare contiene recettori che trasducono l&#39;energia meccanica del suono in energia elettrochimica elaborati dal sistema nervoso centrale e periferico. Diverse tecniche di proteomica sono stati sviluppati per studiare l&#39;orecchio interno cocleare, quali l&#39;elettroforesi bidimensionale differenza gel (2D-DIGE), anticorpo microarray e spettrometria di massa (MS). MS è lo strumento più completo e versatile in proteomica e in concomitanza con metodi di separazione può fornire un proteoma approfondita dei campioni biologici. Metodi di separazione in combinazione con MS ha la capacità di arricchire campioni di proteine, di rilevare a basso peso molecolare e proteine ​​idrofobiche, e identificare le proteine ​​abbondanti bassi riducendo la gamma dinamica proteoma. Diverse strategie di digestione possono essere applicate a tutta lisato o frazionata lisato proteico che permettono di migliorare peptide e proteinacopertura della sequenza. Utilizzazione di diverse tecniche di separazione, comprese forte scambio cationico (SCX), a fase inversa (RP), e elettroforesi frazione intrappolamento liquido gel-eluito (GELFrEE) può essere applicato per ridurre la complessità del campione prima dell&#39;analisi MS per l&#39;identificazione delle proteine.

Per ottenere il proteoma più completa dell&#39;epitelio sensoriale cocleare, dissezione dei tessuti pratica è necessario prima di estrazione di proteine ​​e di preparazione del campione. Due tecniche di proteomica può essere utilizzato, fucile e bottom-up proteomica. Per preparare campioni per proteomica fucile, procedura digestione FASP stato utilizzato come illustrato nella Figura 1. Il metodo FASP consente concentrazione di proteine, rimozione di detergenti, e la digestione delle proteine ​?...

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Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Analisi del proteoma dell&#39;epitelio sensoriale cocleare può essere difficile a causa della sua piccola dimensione e perché le proteine ​​di membrana sono difficili da isolare e identificare. Sia membrana e proteine ​​solubili possono essere identificati dalla combinazione di più metodi di preparazione e le tecniche di separazione con spettrometria di massa ad alta risoluzione.

Bottom-up e Shotgun Proteomica per identificare una completa Cochlear Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Views.  University of South Florida.  Analisi del proteoma dell'epitelio sensoriale cocleare può essere difficile a causa della sua piccola dimensione e perché le proteine ​​di membrana sono difficili da isolare e identificare. Sia membrana e proteine ​​solubili possono essere identificati dalla combinazione di più metodi di preparazione e le tecniche di separazione con spettrometria di massa ad alta risoluzione. 

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Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

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Biologia

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

Proteomica per identificare proteine ​​che interagiscono con P2X2 Ligand-Gated canali di comunicazione

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produzione di<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Uovo Estratti per identificare RNA associata ai microtubuli

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly using MALDI (matrix&#160;assisted laser desorption/ionization)-based analytical techniques. New matrices for small-molecule MSI, which can improve the analysis of low-molecular weight (MW) compounds, are needed. These matrices should provide increased analyte signals while decreasing MALDI background signals. In addition, the use of ultrahigh-resolution instruments, such as Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometers, has&#160;the ability to resolve analyte signals from matrix signals, and this can partially overcome many problems associated with the background originating from the MALDI matrix. The reduction in the intensities of the metastable matrix clusters by FTICR MS can also help to overcome some of the interferences associated with matrix peaks on other instruments. High-resolution instruments such as the FTICR mass spectrometers are advantageous as they can produce distribution patterns of many compounds simultaneously while still providing confidence in chemical identifications. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging. In this work, a protocol for the use of DT for MALDI imaging of endogenous lipids from the surfaces of mammalian tissue sections, by positive-ion MALDI-MS, on an ultrahigh-resolution hybrid quadrupole FTICR instrument has been provided.

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging of small molecules; protocols for the use of DT for the MALDI imaging of endogenous lipids on the surface of tissue sections&#160;by positive-ion MALDI-MS on an ultrahigh-resolution quadrupole-FTICR instrument are provided here.

Dithranol come Matrix Assisted Laser per Matrix desorbimento / ionizzazione Imaging su una trasformata di Fourier Ionorisonanza Ciclotronica Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.