This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

1. Ion-selettivi autoreferenziale microelettrodo Preparazione <ol><li> Preparazione di microelettrodo ione-selettivi <ol><li> Tirare calore sottili capillari borosilicato a parete senza filamento (diametro esterno 1,5 mm 1,12 millimetri di diametro interno) con un estrattore microelettrodo. Nota: questo dà consigli 3-4 micron di diametro. Punte piccole hanno resistenza superiore che rende microelettrodi più sensibili al rumore elettronico ed è anche associato ad una risposta più lenta ad una variazione della concentrazione di ioni. Informazioni utili si possono trovare nel documento pubblicato da Smith et al. 26. </li><li> Silanizzata gli elettrodi per rendere idrofoba la superficie interna per favorire la ritenzione del cocktail ionoforo lipofilo. Posizionare i microelettrodi in un rack metallo e calore O / N in stufa a&gt; 100 ° C per asciugarlo. Il rack è una piastra metallica con due millimetri fori di diametro forato parte fino in fondo. Posizionare gli elettrodi nei fori punta verso l&#39;alto con una da 250 ml gcoppa lass su di loro. </li><li> Al mattino, spegnere il forno e indossando guanti isolanti, rimuovere con attenzione il rack di metallo con gli elettrodi e coppa in atto. Chiudere la porta del forno per trattenere il calore. </li><li> Indossare lattice o nitrile, camice da laboratorio e occhiali di protezione. Con una plastica pipetta Pasteur, una goccia di soluzione di silanizzazione che alla base di ciascun elettrodo (mantenere il becher in luogo, utilizzare il beccuccio per l&#39;accesso pipetta). La soluzione silanizzazione viene vaporizzato dalla piastra calda e silanizes l&#39;interno degli elettrodi. Utilizzare una cappa aspirante chimico per questa fase. Posizionare i rack / bicchiere / elettrodi in forno caldo per qualche ora per permettere qualsiasi soluzione silanizzazione residuo di evaporare. Nota: per motivi di sicurezza, non accendere il forno indietro. Collocare un&#39;etichetta sul forno indicare che non deve essere acceso in quanto può contenere vapori nocivi e infiammabili. </li><li> Dopo il raffreddamento, memorizzare i microelettrodi in una memoria microelettrodo barattolo inside essiccatore bicchiere con 400 g di essiccante. Microelettrodi possono essere conservati così per molte settimane. Nota: Un metodo alternativo è descritto silanizzazione in Smith et al 26. </li><li> Back-riempire il microelettrodo con 50 a 100 microlitri (una lunghezza di circa 1 cm) di una soluzione contenente 100 mM dello ione da misurare (vedi Tabella 1 e Figura 1B). Utilizzare una plastica Pasteur calore pipetta monouso tirato in un becco Bunsen per una multa filamento. Sciacquare la pipetta in dH 2 O in seguito per evitare il blocco. Nota: In alternativa, regolare la concentrazione di ioni della soluzione riempimento per abbinare la concentrazione di ioni nella soluzione esterna 27. </li><li> Osservare il microelettrodo sotto un microscopio da dissezione per garantire l&#39;assenza di bolle d&#39;aria. <ol><li> Se le bolle sono presenti rubinetto microelettrodo leggermente con un&#39;unghia mentre si tiene l&#39;elettrodo in verticale (punta verso il basso) e / o spingere la bollas la punta applicando contropressione usando una siringa modificato con un tubo in silicone sostituire l&#39;ago. </li></ol></li><li> Tip-riempire il microelettrodo con 15-20 nl (una lunghezza di 30-50 micron) di specifici ioni ionophore cocktail (vedi tabella 1). Mettere una piccola goccia di ionophore cocktail sul lato corto di un vetrino da microscopio. Osservare la punta microelettrodo sotto un microscopio da dissezione e spostarlo verso il vetrino da microscopio fino alla punta microelettrodo tocca il cocktail ionoforo solo per circa mezzo secondo. Disegnare il cocktail ionoforo nel microelettrodo dalla pressione capillare. Nota: evitare una lunga colonna di ionophore cocktail come questo aumenta la resistenza elettrica della sonda che può rendere sensibili alle interferenze elettroniche (rumore) e rallenta anche il tempo di risposta. </li><li> Montare il microelettrodo in un supporto microelettrodo dritto con un oro 1 millimetri connettore maschio e AgCl (Ag +) filo (Figura 1B). &lt;/ Li&gt; <li> Fissare il supporto microelettrodo allo stadio testa montata su un computer controllato tridimensionale micropositioner elettronico (Figura 1A). </li><li> Posizionare la punta microelettrodo in misura soluzione appropriata per il campione da misurare (soluzione salina fisiologica, terreno di coltura, etc.) per consentire il microelettrodo si stabilizzi per un ora o due, o anche durante la notte. </li></ol></li><li> Preparazione dell&#39;elettrodo di riferimento <ol><li> Elettrodi di riferimento (Figura 1C) sono gli stessi capillari come sopra. Tagliare il capillare con una matita diamante in cinque centimetri di lunghezza e fuoco lucidato a ciascuna estremità per 1-2 secondi in una fiamma Bunsen. </li><li> Riempire questi elettrodi con ~ 200 ml di una soluzione di NaCl 3 M, CH 3 CO 2 K (acetato di potassio) o KCl con 2% di agarosio. Scegliere la soluzione a seconda dello ione da misurare (l&#39;elettrodo di riferimento non deve contenere lo ione da misurare; vedere Tabella 1). Mescolarel&#39;agarosio e la soluzione e calore per quasi bollire in un forno. Mescolare per sciogliere l&#39;agarosio (la soluzione va chiaro). </li><li> Attaccare l&#39;elettrodo di riferimento a un Pasteur pipetta di plastica e disegnare la soluzione calda nel capillare. </li><li> Eliminare l&#39;elettrodo nella fredda 3 M NaCl, CH 3 CO 2 K o soluzione KCl e conservare in questa soluzione 3 M in tubi sigillati prima dell&#39;uso. Eliminare eventuali elettrodi di riferimento con le bolle d&#39;aria. </li><li> Montare l&#39;elettrodo di riferimento in un supporto microelettrodo retta pellet (pre-riempita con 3 M soluzione) con AgCl (Ag +) all&#39;interno ed un oro 2 millimetri connettore maschio (Figura 1C) e fissare l&#39;elettrodo e supporto su un micro-posizionatore manuale montato su un supporto magnetico. </li></ol></li></ol> 2. Ion-selettivi autoreferenziale microelettrodo Calibrazione <ol><li> Preparare soluzioni taratura contenenti lo ione di interesse come nella soluzione di riferimento; vedi Tabella 1 </strong&gt;. Staffa la concentrazione che è nella soluzione campione sarà in (es terreni di coltura, soluzione salina fisiologica). Cioè, una soluzione di calibrazione deve contenere una concentrazione inferiore di ioni che nella soluzione di misura, e uno superiore. <ol><li> Ad esempio, utilizzare salina contenente 1 mM di K +. Alla staffa questa concentrazione, sciogliere KCl polvere in acqua deionizzata ad una concentrazione di 10, 1 e 0,1 mM in diluizioni seriali. Utilizzare queste soluzioni di taratura. In alternativa, utilizzare almeno due di queste soluzioni. </li></ol></li><li> Immergere il microelettrodo ione-selettivo e l&#39;elettrodo di riferimento in ciascuna soluzione di taratura e lasciare che il valore di tensione stabilizzi per 1 a 3 min prima di registrare la tensione corrispondente utilizzando il software dedicato (vedi Tabella 1). </li><li> Poiché il software salva i dati (uscita dell&#39;amplificatore) come un file txt, copiare i dati in un file di foglio di calcolo. Tracciare l&#39;uscita microelettrodo (mV) contro il logaritmo dellala concentrazione molare di ioni (Figura 2A). </li><li> Applicare una regressione lineare e calcolare il Nernst pendio, intercettare e valore R 2. Accettare il microelettrodo se la pendenza di Nernst è 58 ± 11 mV / decade per gli ioni monovalenti e 29 ± 11 mV / decade per ioni bivalenti (per cationi, la pendenza Nernst è positivo, per anioni è negativo). Inoltre, buone microelettrodi dovrebbero avere una forte correlazione lineare (R 2&gt; 0.9; Figura 2B). Nota: L&#39;uscita mV dell&#39;amplificatore usato qui dà lettura mV con un guadagno di dieci volte. I valori devono essere diviso per un fattore di dieci. </li><li> Utilizzare la formula di regressione lineare per convertire l&#39;uscita grezza mV del microelettrodo in concentrazione di ioni reale (Figura 2B). </li></ol> 3. La convalida della tecnica microelettrodo ionoselettivo <ol><li> Preparazione di una sorgente artificiale <ol><li> Capillari sorgenti artificiali sono le stesse come capillarisopra. Calore tirare il capillare con un estrattore microelettrodo come al punto 1.1.1. </li><li> Backfill questi capillari con 200 ml di una soluzione di NaCl, KCl 1 M, CaCl 2 2 H 2 O o pH 4 buffer. Scegliere la soluzione sorgente artificiale seconda ione da misurare (vedi Tabella 1). Nota: in alternativa, tirare elettrodi con grande diametro della punta (~ 20 micron) e mancia riempire con le stesse soluzioni, ma contenente 0,5-1% agarosio (agarosio impedirà qualsiasi flusso di massa di soluzione). </li><li> Montare capillare sorgente artificiale su un micromanipolatore ed immergerlo nella soluzione usata per misurare il flusso dello ione nei campioni. Lasciare la sorgente artificiale nella soluzione per 30 minuti per 1 ora per permettere la stabilizzazione del gradiente. </li></ol></li><li> Convalida del microelettrodo ionico selettivo <ol><li> Immergere il microelettrodo ionoselettivo circa un centimetro di distanza dal capillare sorgente artificiale nella soluzione utilizzata per misure il flusso di ioni sui campioni e chiudere il circuito con l&#39;elettrodo di riferimento come prima. Che il valore di tensione stabilizzi per 1 a 3 min prima di registrare la tensione corrispondente utilizzando il software dedicato per 1 a 2 min. Questo valore corrisponde al valore del tampone (in letteratura indicato anche come riferimento, sfondo o valore di bianco). </li><li> Spostare il microelettrodo ionoselettivo a circa 5 micron dalla sorgente artificiale e lasciare che il valore di tensione stabilizzi per 1 a 3 min prima di registrare la tensione corrispondente utilizzando il software per 1 a 2 min. </li><li> Ripetere la procedura sopra posizionando il microelettrodo selettivo ione a 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 e 1280 micron lontano dal capillare sorgente artificiale. </li><li> Estrarre i dati come un file txt e copiare i valori in un foglio di calcolo. </li></ol></li><li> Calcolare la concentrazione di ioni corrispondente ai valori mV nello stesso modo come per i valori di calibrazione. Tracciare il valore. Note: Se un flusso di ioni è presente, il microelettrodo rileva una differenza di concentrazione di ioni tra le due posizioni (Figura 3B). Se la sorgente artificiale contiene più ioni della specie misurati rispetto alla soluzione, la concentrazione dovrebbe essere superiore vicino alla fonte di lontano, convalidando la capacità del microelettrodo ione-selettivo, per rilevare correttamente la direzione di un flusso di ioni (in questo caso efflusso, per un dissipatore artificiale, con una concentrazione di ioni specifico inferiore misura media, dovrebbe essere afflusso). <ol><li> Calcolare il flusso ionico usando la legge di Fick di diffusione: J = c μ (dc / dx) dove c è la concentrazione di ioni nella soluzione (mol cm -3), μ è la mobilità ionica (mol cm N -1 sec -1) e dc è la differenza di concentrazione a distanza dx (cm) (Figura 2C). Dati flusso di ioni di solito sono presentati in pmol cm -2 s-1 O nmol cm -2 s -1. Nota:.. Un metodo alternativo di calcolo flusso di ioni descritto da Smith et al 26 può essere utilizzato. Differenze principali includono l&#39;uso del coefficiente di diffusione anziché la mobilità ionica e la sottrazione del flusso sfondo ione (anche tensione deriva o fattore di correzione) calcolata dalla misura del flusso di ioni in soluzione salina senza campione. </li><li> Tracciare la media dei flussi ionici di ogni passo contro la distanza dalla sorgente (Figura 2D). Allontanandosi dalla sorgente, osservare una diminuzione esponenziale del valore di flusso convalidare la capacità del microelettrodo ione-selettivi per rilevare diversa grandezza dei flussi ionici. </li><li> Effettuare la convalida sorgente artificiale volta per ogni ione specifico destinato ad essere registrata per convalidare il corretto direzione e la grandezza misurazioni con un grande segnale-nRapporto Oise. Nota: Ion misurazione del flusso del buffer senza campioni risulta il livello di fondo o rumore. Tipicamente, la misura del buffer non presenta alcuna chiara fluttuazione della concentrazione di ioni conduce a molto piccolo flusso che mostra direzioni variabili. </li></ol></li></ol> 4. Preparazione della camera di misurazione Nota: Prima di esperimenti, si consideri il campione da misurare e come il campione deve essere montato e immobilizzato per misure microelettrodi. <ol><li> Per Xenopus laevis misurazioni ovociti tagliati da 1 cm quadrato di una rete di 800 micron di nylon (maglia Nitex) e colla in un piatto di plastica Petri (Figura 1E). </li></ol> 5. Ion Flux misura <ol><li> Misurare la concentrazione di ioni presenti nel buffer utilizzato per eseguire le misurazioni sul campione nello stesso modo come per la soluzione di calibrazione. X. ovociti laevis richiedono Modified Ringer Mark (MMR). Dissolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl e HEPES in acqua deionizzata per raggiungere una concentrazione finale di (mM): 100 NaCl, KCl 2, 2 CaCl, 1 MgCl e 5 HEPES. Regolare il pH del tampone a 7,5 usando NaOH. </li><li> Posizionare il campione nella camera di misura e portare il microelettrodo ionoselettivo vicino al campione (circa 10 micron di distanza) utilizzando il micropositioner per definire la posizione di chiusura del microelettrodo (Figura 3A). </li><li> Avviare l&#39;escursione bassa frequenza (0,3 Hz) (100 micron) del microelettrodo tra la posizione di chiusura ed una posizione di distanza dal campione (distante) utilizzando il software dedicato. Assicurarsi che il movimento del microelettrodo è perpendicolare alla superficie del campione. Nota: L&#39;escursione del microelettrodo può essere impostato sul software. Grande escursione aumenta il gradiente di lettura permettendo una facile individuazione di piccoli flussi durante il tempo di misurazione allunga l&#39;intervallo di campionamento e diminuisce la risoluzione temporale. Vedere <strong&gt; Figura 3A per un esempio. </li><li> Avviare la registrazione tramite il software. Il microelettrodo ferma in ogni punto ed il potenziale elettrico in mV è registrato sul computer. Ottenere misurazioni per almeno 2 minuti, consentendo la stabilizzazione del segnale. Per gli esperimenti time-lapse brevi, registrano potenziali variazioni in corrispondenza della posizione di interesse per tutto il corso del tempo. </li><li> Estrarre i dati come un file txt e copiare i valori in un foglio di calcolo. </li><li> Calcolare la concentrazione di ioni corrispondente ai valori mV nello stesso modo come per i valori di calibrazione. Tracciare il valore. Nota: Se un flusso di ioni è presente, il microelettrodo rileva una differenza di concentrazione di ioni tra le due posizioni (Figura 3B). </li><li> Calcolare il flusso ionico usando la legge di Fick di diffusione come prima (fase 3.3.1). </li><li> Ripetere la misura tampone prima di misurare un nuovo campione e ripetere la procedura di misura del flusso e di calcolo per ogni nuovocampione. </li></ol> 6. Analisi statistica dei dati e presentazione <ol><li> Verificare gli effetti indipendenti della posizione e / o del tempo su flussi ionici sotto la condizione di controllo che utilizzano un modello ANCOVA con effetti misti 28. Nota: L&#39;analisi della covarianza (ANCOVA) è un modello lineare generale che mescola regolare ANOVA e regressione, consentendo misure sia categoriali e continui a essere utilizzati come variabili indipendenti. Inoltre, in presenza di errori correlati indotti da misure ripetute per effetti nidificati individuali ed eventuali, modelli ad effetti misti vengono utilizzati per modellare stime accurate sia effetti fissi e casuali. </li><li> Calcola confronti a coppie con Student t-test tra i livelli di gruppo con correzione di Bonferroni per test multipli 28. </li><li> Generare grafici a scatole per riassumere misure di flusso di ioni a seconda della posizione e del tempo. Includere valori di p dalla t Student coppie descrittosopra (Figura 3D) e indicare i livelli di significatività dei valori p come segue: *: p &lt;0.05; **: P &lt;0.01; ***: P &lt;0.001 29 </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Le fasi più critiche per la misurazione successo flussi ionici extracellulari in vivo sono: la riduzione del rumore, la corretta realizzazione dell&#39;elettrodo microelettrodi ionoselettivi e riferimento, e il posizionamento del campione e due elettrodi. Per minimizzare il rumore, il sistema di registrazione dovrebbe essere collegato a terra (massa) gabbia di Faraday preferibilmente con un (isolamento dalle vibrazioni) Tavolo metallo con ripiano che è anche collegata a terra. Ino...

<html> Tutte le cellule animali sono circondate da una membrana a doppio strato lipidico che separa il citoplasma dall&#39;ambiente esterno. La cella mantiene un potenziale di membrana elettrico, negativa all&#39;interno, dal trasporto attivo di ioni 1. Il potenziale di membrana è una fonte di energia accumulata che la cellula può utilizzare per operare vari dispositivi molecolari nella membrana 2. I neuroni e le altre cellule eccitabili hanno grandi potenziali di membrana. Rapid apertura dei canali del sodio crolla il potenziale di membrana (depolarizzazione) e produce il potenziale di azione che viene trasportato lungo la lunghezza del neurone 2. Oltre a questi cambiamenti rapidi elettrici, molti tessuti e organi generare e mantenere significativi potenziali elettrici a lungo termine. Ad esempio, la pelle e dell&#39;epitelio corneale generare e mantenere potenziali trans-epiteliali e correnti elettriche extracellulari pompando direzionale di ioni (soprattutto sodio e cloruro) 3. tenda &quot;&gt; Mentre misure di corrente elettrica endogena extracellulare utilizzando la sonda vibrante 4-6 e le misurazioni dei potenziali di membrana o trans-epiteliali utilizzando il sistema microelettrodo 7-10 consentire la misurazione dei parametri elettrici di membrane cellulari e strati di cellule epiteliali, non danno indicazione della specie ionici coinvolti. Microelettrodi con ionophore selettivo in grado di misurare la concentrazione di ioni in soluzione specifica. Gradienti ionici o flusso possono essere misurati con due o più elettrodi in posizioni diverse. Tuttavia, la deriva della tensione intrinseca di ciascuna sonda sarebbe diversa, causando misurazioni imprecise o anche il rilevamento di un gradiente che non era presente. Un singolo elettrodo utilizzato in modalità &quot;auto-riferimento&quot; in cui si muove a bassa frequenza tra due punti risolve questo problema. Ora il flusso di ioni può essere visto sullo sfondo di una deriva del segnale relativamente lento e stabile (vedere Figura 3B). </p&gt; Il sistema di misurazione sensibile agli ioni utilizza microelettrodi autoreferenziali ionoselettivi di rilevare piccoli flussi extracellulari di ioni nei pressi di tessuti o cellule singole. Il sistema è costituito da un amplificatore che elabora il segnale dal microelettrodo e un motore passo-passo micro e guidatore a controllare il movimento del microelettrodo. Il microelettrodo ione-selettivo e l&#39;elettrodo di riferimento che chiude il circuito sono collegati all&#39;amplificatore tramite un headstage preamplificatore (Figura 1A). Software determina i parametri del movimento microelettrodo (frequenza, distanza) e registra anche l&#39;uscita dell&#39;amplificatore. Il motore passo-passo controlla il movimento tramite un microelettrodo micropositioner tridimensionale. Una bassa frequenza di oscillazione microelettrodi ione-selettivo è stato sviluppato nel 1990 per misurare il flusso di calcio specifica 11. Così come il calcio, cocktail ionofori accessibili in commercio sono ora disponibili a fare microelectrodes sensibile al sodio, cloruro, potassio, idrogeno, magnesio, nitrato, ammonio, fluoruro, litio o mercurio. Fondamentalmente, la tecnica microelettrodo ionoselettivo autoreferenziale converte l&#39;attività di uno ione specifico disciolto in una soluzione in un potenziale elettrico, che può essere misurata con un voltmetro. Il cocktail ionoforo è un liquido immiscibile fase (organica, lipofila) con proprietà a scambio ionico. L&#39;ionoforo complessi selettivamente (binding) ioni specifici reversibilmente e li trasferisce tra la soluzione acquosa contenuta nel microelettrodo (elettrolita) e la soluzione acquosa in cui è immerso il microelettrodo (Figura 1D). Questo trasferimento di ioni porta un equilibrio elettrochimico e una variazione di potenziale elettrico tra il microelettrodo e l&#39;elettrodo di riferimento è misurata dal voltmetro. La tensione è proporzionale al logaritmo dell&#39;attività ione specifico secondo l&#39;Nernst equation consentendo il calcolo della concentrazione di ioni (Figura 2A e B). Attualmente, alcuni sistemi permettono la misurazione del flusso ionico usando un concetto o principio simile. Ad esempio, l&#39;elettrodo tecnica di scansione ionoselettivo (SIET) 12,13 o il (MIFE) tecnica microelettrodo Ion Flux Stima sviluppata da Newman e Shabala 14-16 sono disponibili in commercio e ampiamente utilizzati dalla comunità di ricerca al fine di determinare ione specifico fondenti si verificano a membrana e tessuti cellulari attraverso una varietà di animali, piante e modelli a cella singola vita. Microelettrodi ionoselettivi sono stati utilizzati per misurare l&#39;idrogeno, il potassio e il flusso di calcio attraverso le radici delle piante 17, flux cloruro nel ratto arterie cerebrali 18 e in tubetti pollinici 19, flusso di idrogeno in cellule retiniche pattino 20, flusso di calcio nelle ossa del mouse 21, ione vari flussi di ife fungine e 22 in ra 23 della cornea, e, infine, il flusso di calcio durante ferita singola cellula di guarigione 12,24. Si veda anche la seguente recensione per informazioni dettagliate sul ionoselettive autoreferenziali microelettrodi 25. Il seguente articolo descrive in dettaglio come preparare ed eseguire la misurazione di flussi ionici endogeni extracellulari utilizzando l&#39;autoreferenziale tecnica microelettrodi ionico selettivo a livello di singola cellula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IonAmp&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonAmp32&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage pre-amplifier</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>INA116</td>
			<td>BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroStep Driver</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micropositioner&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>Model KITE-R</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Model M10</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table&#160;&#160;</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model VW-3036-OPT-023040</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90&#176;, slotted faces</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model 360-90</td>
			<td>Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>460PD-X</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel</td>
			<td>Newport Inc.</td>
			<td>460A-XY</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>&#160;PC-10</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal rack</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>none</td>
			<td>Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>QL</td>
			<td>Model 10 Lab Oven</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silanization solution I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85126</td>
			<td>Hazardous, handle as recommended by provider&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish; Pyrex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode/micropipette storage jar</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>E215</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-595E</td>
			<td>Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11597722</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S97329</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>QSW-A15P</td>
			<td>with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3S</td>
			<td>with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60872-306</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh</td>
			<td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td>
			<td>NTX750</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue; Loctite epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>500043-451</td>
			<td>Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>99053</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>none</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode technique

Le cellule ottenute da animali, piante e cellule singole sono racchiusi da una barriera chiamato la membrana cellulare che separa il citoplasma dall&#39;esterno. Strati cellulari come epiteli formano anche una barriera che separa l&#39;interno dall&#39;esterno o diversi compartimenti di organismi multicellulari. Una caratteristica fondamentale di queste barriere è la distribuzione differenziale di ioni attraverso le membrane cellulari o strati di cellule. Due proprietà consentono questa distribuzione: 1) membrane e epiteli mostrano permeabilità selettiva di ioni specifici; 2) gli ioni sono trasportati attraverso le pompe attraverso le membrane cellulari e strati di cellule. Queste proprietà giocano un ruolo cruciale nel mantenimento della fisiologia dei tessuti e fungono da segnalazione spunti dopo i danni, durante la riparazione, o in condizioni patologiche. L&#39;auto-riferimento microelettrodo ionoselettivo consente misurazioni di flussi specifici di ioni come calcio, potassio o sodio a livelli cellulari e tissutali singoli. Il microelettrodo contiene un cocktail ionoforo che èselettivamente permeabile ad uno ione specifico. La soluzione di riempimento interna contiene una concentrazione insieme di ione di interesse. Il potenziale elettrico del microelettrodo è determinata dalla concentrazione fuori dello ione. Poiché la concentrazione di ioni varia, il potenziale del microelettrodo cambia in funzione del log della attività ionica. Quando spostato avanti e indietro vicino a una fonte o affondare dello ione (cioè in un gradiente di concentrazione dovuto al flusso di ioni) il potenziale microelettrodo oscilla ad una ampiezza proporzionale al flusso di ioni / gradiente. L&#39;amplificatore amplifica il segnale microelettrodo e la produzione è registrata sul computer. Il flusso di ioni può essere calcolata dalla legge di Fick della diffusione usando le fluttuazioni potenziale dell&#39;elettrodo, l&#39;escursione di microelettrodo, e altri parametri quali la mobilità ionica specifico. In questo articolo, si descrive nel dettaglio la metodologia per misurare flussi ionici extracellulari con il autoreferenziale microelettrodi uno ione-selettivod presentare alcuni risultati rappresentativi.

Abbiamo precedentemente dimostrato che l&#39;influsso di calcio compare dopo singola cellula ferendone 24. Abbiamo quindi chiesto se gli altri flussi ionici si verificano su di ferimento singola cellula. Abbiamo usato la X. laevis ovocita, un modello consolidato per singola cella la guarigione delle ferite 30-34 e registrazione elettrofisiologica 24,35-39. È interessante notare, gli ioni potassio sono più concentrati all&#39;interno X. laevis ovociti (circa 110 mm) <s...

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Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Misurazione della extracellulare Ion Flussi Utilizzando il ionoselettivo autoreferenziale microelettrodo Tecnica

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Views.  University of California, Davis. Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Video: Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Ricerca

Biologia

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

Ricapitolazione di una curva Ion Canale IV Uso dei componenti di frequenza

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Misurare flussi di calcio veloce in cardiomiociti

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Misurazione del tasso metabolico in<em&gt; Drosophila</em&gt; Utilizzando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Caratterizzazione funzionale di Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Scambiatori di intracellulare compartimenti, utilizzando Proton-uccidere selezione di esprimerle livello della membrana plasmatica

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Tecniche per l&#39;Analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Misura e Analisi di extracellulare Acido prodotte per determinare glicolitica Tasso

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Istituzione di un pH extracellulare acido sistema cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...