This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

1. Costruire Molecolare e Peanut Trasformazione <ol><li> Unire frammenti di DNA di cinque A. geni flavus, AFL2G_07223 (AFLS o aflJ), AFL2G_07224 (AFLR), AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1), AFL2G_07731 (pes1) e AFL2G_05027 (pompa di efflusso aflatossina, aflep). Per questo, utilizzare i seguenti primer e ultramers: DIR-1, Short-Dir1-R, DIR-2-rovesciata, Short-Dir2-R, DirAll-NCO-Rv, e DirAll-BamEco-Fw, tabella 1. <ol><li> Fai DIR-1 doppio filo da 5 cicli di PCR (reazione di 25 ml; 95 ° C 2 min, seguito da 5 cicli di 94 ° C 45 sec, 55 ° C 30 sec, 68 ° C 15 sec), utilizzando la DNA polimerasi secondo il fornitore di istruzioni e fondo Short-Dir1-R per lasciare un CCCGT 3 &#39;overhang. Ripetere questi passaggi per fare doppio filo DIR-2-invertita con iniettore a breve Dir2-R per lasciare un ACGGG 3 &#39;overhang complementare alla DIR-1. </li><li> Legare il Fragme due 199 bpnti con T4 DNA Ligase come da istruzioni del produttore. PCR amplifica la risultante frammento di 393 bp, come indicato in 1.1.1 con primer DirAll-CACC-FW e DirAll-NCO-Rv (Tabella 1), e clonare il prodotto utilizzando tecniche standard in pENTR1A fare plasmide p2 + 4ENTR. </li><li> Ricombinare p2 + 4ENTR in pCAPD 29 (NCBI adesione: KC176455.1) utilizzando LR clonase II mix enzima secondo le istruzioni del produttore per fare plasmide p5XCAPD, e trasformarlo in Escherichia coli DH5α utilizzando tecniche standard seguiti da sequenziamento parziale. Nota: L&#39;inserto RNAi finito è mostrato nella Tabella 1. </li></ol></li><li> Trasforma Agrobacterium ceppo C58C1 30 con il plasmide p5XCAPD come riportato in precedenza 30, e utilizzare il batterio risultante di trasformare le piante di arachidi come segue: <ol><li> Grow a 30 ° C la Agrobacterium ospitare p5XCAPD, utilizzare per questo, da 50 ml LB-Broth integrato con 500mg ml -1 streptomicina, 25 mg ml -1 gentamicina, 10 mg ml -1 kanamicina, e scuotere la cultura a 250 rpm fino a raggiungere 1 260 OD. </li><li> Raccogliere le cellule tumefaciens per centrifugazione (6000 x g) per 10 minuti, risospendere in 50 ml di AB minima quantità di terreno 31 con 100 micron acetosyringone per 1 ora, e il luogo in sospensione batterica espianti di 10-14 giorni di età piantine Exp27-1516, corridore tipo linea di riproduzione di arachidi. Blot asciugare gli espianti su 3MM carta assorbente dopo 30 minuti, e metterli a medio shoot-induzione (SIM) [MS sale 32, 3% di saccarosio, 20 mM benzilaminopurina (BAP), 10 mM thidiazuron (TDZ), pH 5,8, 0,3 % gellano gomma] senza antibiotici al buio per tre giorni. </li><li> Fare selezione tessuti e la rigenerazione come riportato prima 33. Spostare i tessuti su SIM (500 micron cefotaxime e 100 micron kanamicina) per la formazione di riprese, con trasferimenti bisettimanali per 2 mesi. Poi postoespansione spara a medio shoot-allungamento (SEM) [5 micron BAP, 1 mM acido gibberellico (GA 3)], bi-settimanale per diversi mesi. </li><li> Posizionare i singoli tiri, 2 cm di dimensioni, in media radice-induzione (RIM) [1/2 ms, 1,5% di saccarosio, 5 micron α-naftalene-acido acetico (NAA), 2,5 micron indolo-butirrico (IBA)], quindi acclimatare le piante e trasferirle alla serra. </li></ol></li></ol> 2. Identificazione di arachidi piante ospitano RNAi di geni Silenzio Aflatossina sintesi <ol><li> Usa impianto mini kit in una stazione di lavoro robot con 200 eluizione microlitri secondo le istruzioni del produttore per estrarre il DNA da foglie giovani di piante di arachidi che sono state soggette al processo di trasformazione (come descritto in precedenza) con RNAi costruire p5XCAPD (Figura 1), che ha come spina dorsale plasmide pCAPD 29 per silenziamento genico. </li><li> Schermo i campioni di DNA da parte del singolo-tubo nested PCR (STN-PCR), come descritto previneamente 34 per rilevare il marcatore NPTII selezionabili e la RNAi inserire da p5XCAPD. Clonale propagarsi dai tagli (3-4 nodi) PCR piante positivi per la produzione di sementi sufficienti per le prove in questa prima generazione. <ol><li> Utilizzare quattro diluizioni 2-fold di DNA (50-100 ng ml -1 prima della diluizione) in tutte le reazioni STN-PCR. Per NPTII, utilizzare primer esterni PCAPD 5714F: 5&#39;-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3 &#39;e PCAPD 6446R: 5&#39;-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3&#39;, e fondi interni PCAPD 5730F: 5&#39;-ACTGGGCACAACAGACAATC-3 &#39;e PCAPD 6249R: 5&#39;-ATATTCGGCAAGCAGGCATC- 3 &#39;. </li><li> Per il rilevamento di RNAi inserire nelle reazioni STN-PCR utilizzare primer esterni 35S-PDSFw: 5&#39;-CCTAACAGAACTCGCCGTAA-3 &#39;e DirAll-NCO-Rv: 5&#39;-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3&#39;, e primer interni Probe_5027_Fw: 5&#39;-gtatttgtgaccatgtttctg-3 &#39;e Probe_7228_Rv: 5&#39;-GGACGGATAGTAAACTGCGG-3&#39;. </li></ol></li><li> Harvest baccelli arachidi provenienti dagli impianti positivi STN-PCR e del con<html> piante coltivate trollo nelle stesse condizioni. PUNTO CRITICO: Assicurarsi che il controllo piante sono coltivate nelle stesse condizioni e la stessa stagione, come le piante RNAi. Scoppio dell&#39;acqua i baccelli con una idropulitrice a bassa intensità o raschiare a mano per rimuovere esocarpo, determinare il colore del mesocarpo mettendo i baccelli su una tavola di maturità e cialde separati in gruppi (giallo, arancio, marrone e nero) 35 (Figura 2). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig2.jpg" /> Figura 2. Preparazione dei baccelli arachidi per l&#39;analisi. Sinistra: I formati differenti arachidi trovato alla raccolta come arachide è una pianta di crescita indeterminata; Centro: ponendo arachidi nel cestino del metallo per la rimozione pressione dell&#39;acqua esocarpo; Destra: gruppi di maturità in base al colore mesocarpo su una scheda profilo di arachidi (giallo, arancio, marrone e nero).98fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 3. Setup sperimentale <ol><li> Rimuovere il scafi, processo giallo e semi marroni separatamente. Calcolare il numero di semi da utilizzare nell&#39;esperimento in base alla tabella 2. Si noti che un minimo di tre pezzi di semi (1 seme pezzo = metà cotiledone) per linea di arachidi e la data di campionamento è necessaria per eseguire analisi statistiche e di ridurre l&#39;errore standard. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="33"><td height="33" style="height:33px;width:147px;"> Nome </td><td colspan="3" style="width:421px;"> Sequenza </td></tr><tr height="124"><td height="124" style="height:124px;"> DIR-1 </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;- GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCGTATTTG TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC ATTCCCCAGATCACGGACGAATCCCCTGCATCTACGCGCACGCATC ACTTGGGGTACCCGT-3 &#39; </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> Short-Dir1-R </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-Phos-TACCCCAAGTGATGCGTGCGCG-3 &#39; </td></tr><tr height="126"><td height="126" style="height:126px;"> DIR-2-invertita </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-GGTTATTGGGTGCAGAATGGTAAACCACCCAACAGTACGCGAAATG TCAATTCCAGAGTCCCAAACCTCCCTACCGTGGCCTGGACGGATAG TAAACTGCGGAGCTTGGGAACAAAATCCGCTGTCTGATCGCCGAAG AGAAAGAGTTGCCTTGATTGAGCCGCATCGAGGACAGGTTGTGTTG CTGTTGATAGACGGG-3 &#39; </td></tr><tr height="29"><td height="29" style="height:29px;"> Short-Dir2-R </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-Phos-CTATCAACAGCAACACAACC-3 &#39; </td></tr><tr height="30"><td height="30" style="height:30px;"> DirAll-CACC-Fw </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-CACCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 &#39; </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> DirAll-NCO-Rv </td><td colspan="3"> 5&#39;-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3 &#39; </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> DirAll-BamEco-Fw </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-ATGGGATCCGAATTCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 &#39; </td></tr><tr height="197"><td height="197" style="height:197px;"> Completa inserto RNAi </td><td colspan="3" style="width:421px;"> 5&#39;-GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTC / GTATTTG TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC ATTCCCCAGATCACGGACGAAT / CCCCTGCATCTACGCGCACGCAT CACTTGGGGTACCCGTCTATCAACAGCAACACAACCTGTCCTCGAT GCG / GCTCAATCAAGGCAACTCTTTCTCTTCGGCGATCAGACAGCG GATTTTGTTCCCAAGCTCCGCAGTTTACTATCCGTCCA / GGCCACGG TAGGGAGGTTTGGGACTCTGGAATTGACATTTCGCGTACTGTTGGG TGGTTTACCATTCTGCACCCAATAACC-3 &#39; </td&gt; </tr></tbody></table> . Tabella 1. oligonucleotidi e ultramers utilizzati per creare il RNAi costruire p5XCAPD Phos: fosforilati 5 &#39;; &quot;/&quot; Separa i cinque frammenti di geni usati; Completa inserto RNAi: sequenza usata come 2 ripetizioni invertite per formare p5XCAPD. <ol start="2"><li> Posizionare interi semi di arachidi in un unico strato in modo da coprire il fondo di un becher sterile. Aggiungere la soluzione 75% di etanolo / acqua (v / v) per coprire i semi e quindi aggiungere un volume uguale della stessa soluzione. Incubare a temperatura ambiente per 30 secondi e poi sciacquare con acqua deionizzata sterile (SDW). </li><li> Aggiungere 2% di ipoclorito nel becher contenente i semi etanolo trattati come segue: aggiungere sufficiente soluzione di ipoclorito 2% per coprire i semi, poi aggiungere un volume uguale della stessa soluzione e incubare per 5 min. PUNTO CRITICO: Sciacquare accuratamente tre volte con un volume di SDW equivalente a 5 volte il volume di ipoclorito usato (figura 3). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig3.jpg" /> Figura 3. installazione sperimentale. Top: la sterilizzazione superficiale di semi di arachidi, prima e dopo l&#39;ipoclorito, la rimozione dei tegumenti (TESTA); Medio: rimozione di embrione e vedere da vicino embrione, poi tagliare cotyledon a metà; basso: cotiledoni metà in acqua distillata sterile, cancellando in sterili assorbente carta, ammaccature su agar acqua, e sistemazione di cotiledoni metà (parte tagliata verso l&#39;alto) sulla superficie agar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="4"><li> Lasciare che il semi-superficie sterilizzato per assorbire immersi in SDW per 2 ore. Mettere i semi su una piastra di Petri sterile, togliere i cappotti di seme con una pinza, separare i cotiledoni, e con un bisturi rimuovere gli embrioni. Nota:Gli embrioni possono essere scartati o utilizzati per rigenerare nuovi impianti. </li><li> Tagliare ogni cotyledon a metà con un bisturi. Per evitare la disidratazione, tenere i pezzi di semi tagliati in acqua sterile fino a quando tutti i semi vengono elaborati. </li><li> Hanno preparato piastre Petri contenenti agar acqua sterile (1,5% agar / acqua; w / v), uno per ogni tre pezzi seme. Fare piccole ammaccature in agar usando pinze, brevemente tamponare l&#39;acqua in eccesso di pezzi di semi di asciugamani di carta sterili, e quindi disporre i pezzi di semi (taglio supino) sulle piastre di agar acqua /. </li><li> Da una coltura fresca di Aspergillus flavus aflatoxigenic NRRL 3357 in terreno agar di Czapek cresciuto a 25 ° C per 10 giorni, preparare una sospensione di spore per 50.000 microlitri SDW, contate con un emocitometro. </li><li> Mettere 2 microlitri della sospensione di spore sulle superfici di taglio di ogni pezzo mezza cotiledone evitando deflusso sui lati, per assicurarsi che le spore ottenere esposti al tessuto seme che ospita RNAi (Figura 4). </li&gt; </ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig4.jpg" /> Figura 4. Semina ed incubazione per l&#39;analisi delle aflatossine. Top: Mezza cotiledone inoculazione con sospensione di spore, e Aspergillus flavus crescita del micelio su metà cotyledon dopo 24 ore di incubazione In basso: a sinistra:. Incubazione di 48 ore su 1,5% agar; Centro: incubazione per 72 ore a 1,5% agar; a destra:. esempio di errata impostazione sperimentale, incubazione per 72 ore a 0,5% agar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="9"><li> Incubare le piastre Petri contenenti cotiledoni mezzo inoculate e non inoculate a 30 ° C al buio fino al campionamento. </li></ol> 4. Il campionamento per l&#39;analisi delle aflatossine e Gene Expression <ol><li> Un prelievo di campionitre esemplari a 24, 48 e 72 ore (opzionale a 96 ore) di incubazione, sia per RT-PCR e per l&#39;analisi delle aflatossine, ogni replica essendo un pezzo (a metà cotyledon). Scegli campioni a caso da piatti diversi su ogni data di campionamento. Utilizzando un tessuto, dolcemente rimuovere spore fungine agar e in eccesso prima di mettere pezzi di sementi in fiale o provette. </li><li> Per l&#39;analisi delle aflatossine, svolge ogni replica (un pezzo) in 4 ml di vite vetro tappo flacone e conservare a -80 ° C. Nota: Data la stabilità chimica di aflatossine, campioni possono essere conservati in questa condizione per alcuni mesi (negli esperimenti correnti solito 1-2 mesi). </li><li> Per la RT-PCR posto ogni replica (un pezzo) di già pronto da 2 ml di macinazione provette contenenti due perle in acciaio inox (2,5 mm di diametro) e tre perle zirconio (2 mm diam). </li><li> Congelare immediatamente (preferibilmente in azoto liquido) tutti i campioni e tenerli a -80 ° C fino al trattamento. </li></ol> 5. L&#39;aflatossina analisi dei singoli Mezza Cotyledon Pezzi <ol><li> Utilizzare la A. flavus inoculati campioni per questa analisi. Portare i campioni a temperatura ambiente per circa 30 minuti, aggiungere quattro volumi (di solito 2-3 ml; w / v) di metanolo (tenere record per calcoli successivi), chiudere i tappi, e incubare O / N (~ 16 ore) nella scuro senza agitazione. </li><li> Inserire una fritta in un minicolonna 1,5 ml di propilene corrispondenza, aggiungere 200 mg di base Al 2 O 3 e ricoprirlo con un altro fritta come descritto in precedenza 36; quindi, inserire un Ultra-High Performance Liquid Chomatographer (UPLC) campionatore automatico fiala sotto la colonna abbastanza vicino per evitare possibili evaporazione dell&#39;eluato. </li><li> In una provetta di vetro monouso (non utilizzare plastica), collocare 0,5 ml dell&#39;estratto metanolo ottenuto nello stadio 4.1, aggiungere 0,5 ml di acetonitrile, mescolare e applicare pipetta 0,5 ml della miscela nella colonna preparato al punto 4.2. Lasciare eluizione nel flaconcino campionatore automatico per gravità (non applicare pressione). Eluizione di solito prende 2-4 minuti, vicino the fiala immediatamente con un berretto compatibili UPLC con setti. Tenere i flaconcini a temperatura ambiente e analizzare loro lo stesso giorno su un UPLC. </li><li> Per la separazione delle aflatossine, fiale luogo autocampionatore contenenti eluati di esempio e fiale Autocampionatore con standard di aflatossine (B 1 e B 2 quando si usa A. flavus) in uno strumento UPLC dotato di un corrispondente UPLC Quaternario Solvent Manager, UPLC gestione campioni, UPLC fluorescente rivelatore, e C 18 2.1 mm x 50 mm, 1,7 micron colonna. <ol><li> Utilizzare una fase mobile isocratica composto da acqua / MeOH / CH 3 CN (64:23:13, v / v / v) ad un flusso di 0,30 ml min -1. Ottenere cromatogrammi che assicurano una separazione di base stabilizzato per il calcolo preciso della concentrazione aflatossina, secondo le istruzioni del produttore 37. </li><li> Confermare l&#39;identità di aflatossine ottenendo i propri dati di massa-spettrale e confrontandoli con i dati pubblicati 38. Utilizzare un isulla presa spettrometro di massa equipaggiato con una interfaccia ESI e relativo software in base alle istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Determinare le concentrazioni di aflatossine con riferimento alle curve di calibrazione ottenute iniettando diverse quantità di corrispondenti standard commerciali di aflatossine B 1, B 2, G 1 e G 2 come suggerito dal produttore UPLC e determinato dal software 37. </li><li> Pezzi posto di semi già estratto con metanolo, in singoli flaconi in vetro per O / N (~ 16 ore) liofilizzazione per determinare il loro peso secco. Quindi, calcolare la concentrazione di aflatossine in ng. G -1 di peso a secco di pezzo seme. </li><li> Per l&#39;analisi dei dati, convertire i risultati aflatossine effettuare il login (ng. G -1 +1), seguito dal test di Tukey per confronti medi. </li></ol> 6. espressione genica, RT-PCR Trattamento dei campioni <ol><li> Prendete i 2 ml di macinazione tubi contengonoing campioni dal -80 ° C freezer, e subito (senza scongelamento) li macinare in un mulino omogeneizzatore tallone a 3.100 rpm per 40 secondi, quindi procedere alla estrazione di RNA con Trizol secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Preparare cDNA da ciascun campione utilizzando 1 mg di RNA e la stessa quantità di oligo dT e esameri casuali, fare una diluizione 1: 8 del cDNA e utilizzare 2 pl per reazione RT-PCR (come descritto in precedenza 39). <ol><li> Per il rilevamento di espressione di RNAi uso dell&#39;inserto primer: RT_5X_1_105F: 5&#39;GGTGGCATTGGACCGTCTTG-3 &#39;, RT_5X_1_232R: 5&#39;-CGCATCGAGGACAGGTTGTG-3&#39;; e RT_5X_2_95F: 5&#39;-CCATGTTTCTGGTGGCATTG-3 &#39;, RT_5X_2_229R: 5&#39;-ATCGAGGACAGGTTGTGTTG-3&#39;. </li><li> Per il rilevamento di espressione del marcatore NPTII selezionabile, uso primer: RT_NPTII_1_6871F: 5&#39;-CTCGCTCGATGCGATGTTTC-3 &#39;, RT_NPTII_1_7004R: 5&#39;-GCAGGATCTCCTGTCATCTC-3&#39;. Utilizzare il gene housekeeping Actina per la standardizzazione, e primer: Actina-Fw: CACATGCCATCCTTCGATTG; Actina-Rv: CCAAGGCAACATATGCAAGCT 40. </li></ol></li><li> Analizzare i risultati di Delta-delta C T metodo standardizzato 41 per l&#39;espressione actina. Rappresentare i risultati come volte maggiore rispetto al controllo. </li></ol>

The authors have nothing to disclose or any conflicts of interest.

Plant-ospitante RNAi mediata silenziamento di geni patogeni fungini è stata dimostrata 27,43, tuttavia, non ci sono pubblicazioni che mostrano la fattibilità del controllo RNAi mediata di accumulo di micotossine nelle piante. Un fattore limitante per questi studi arachidi era la mancanza di un metodo per valutare un non-aflatossina accumulo fenotipo in singole piante, come foglie mostrano sintomi upon infezione fungina di baccelli sotterranee. Inoltre, l&#39;accumulo non-normalmente distribuita di aflatossine, e la necessità di grandi campioni per l&#39;analisi chimica 15,16 hanno ostacolato la quantificazione del potenziale effetto RNAi su un singolo impianto. Il metodo presentato qui è composto da 72 esperimenti hr con cinque semi di eseguire tre prelievi 24 ore di divisione, in triplice copia (Tabella 1, Figura 7). Rispetto alla tipica analisi aflatossine che richiede non meno di 100 g di semi, il nostro metodo è particolarmente adatto per individuaeventi l transgenici di piante di arachidi che inizialmente producono non più di due o tre baccelli. RNA-mediata silenziamento di sintesi aflatossina è stata dimostrata da geneticamente trasformando Aspergillus flavus e A. parasiticus. Poiché AFLR è un regolatore principale della produzione di aflatossine in A. flavus e A. parasiticus 44,45, diventa un bersaglio interessante per silenziamento dell&#39;RNA mediata nelle piante. Tuttavia, le variazioni genetiche in AFLR hanno dimostrato tra specie Aspergillus 46, e le varianti genetiche potrebbero sfuggire silenziamento se non c&#39;è una sequenza perfetta corrispondenza con il segnale RNAi prodotto nella pianta ospite. Così, AFLR è stato uno dei bersagli per tacere nel vettore p5XCAPD, ma non fu l&#39;unico. Ripetizioni invertite del gene AFLR introdotte A. flavus e A. parasiticus da trasformazione ha provocato tacere e minimi o nessun prodottoioni di aflatossine 47 (McDonald et al., 2005b). Inoltre, mettendo a tacere gene Afld impedito la produzione di aflatossina fino al 98% in A. flavus e A. parasiticus in trasformazione diretta 48. Per aumentare la probabilità di successo nel nostro sistema, arachidi è stato trasformato con frammenti ripetere invertite di cinque geni coinvolti nella produzione di aflatossine in A. flavus. Qui è dimostrato che utilizzando p5XCAPD che gli obiettivi per il silenziamento diversi geni in via di sintesi aflatossina, il 90% più bassi -100% i livelli di aflatossina B 1 e B 2 sono stati raggiunti in linea 288-72, e livelli inferiori 60-100% accumulato in Linea 288-74 rispetto al controllo, quando cotiledoni metà sono stati inoculati con A. flavus, Figure 4, 7. Ancora più importante, questo metodo ha rilevato differenze statisticamente significative nella accumulo di aflatossina di linee 288-72, 288-74 contro il controllo di tutto l&#39;esperimento, applicando statis parametricatic, Figura 7. Data la piccola dimensione del campione, è importante sottolineare la necessità di utilizzare un metodo efficace per rilevare aflatossine, questi esperimenti sono stati analizzati da UPLC che ha una alta risoluzione, cinque volte maggiori prestazioni e sensibilità tre volte superiore HPLC 49. L&#39;espressione della RNAi inserto 288-74 è stato rilevato solo in cotiledoni immaturi (giallo) a 24 ore di incubazione. L&#39;inserto RNAi non è stato rilevato mediante RT-PCR su cotiledoni maturi 288-74 a 24 ore, o in qualsiasi gruppo maturità a 48 ore, la Figura 6. Lo stesso fenomeno è stato osservato in altre linee di arachidi transgeniche RNAi (Arias, RS, 2015 inedito), dove di solito trascrizioni RNAi sono stati rilevati solo sulla cotiledoni immaturi a 24 ore. Campioni di RNA sono stati trattati con DNasi prima sintesi di cDNA, i dati sono stati normalizzati al livello di espressione Actina e nessuna evidenza di contaminazione del DNA è stata osservata. Nel caso del DNA sono stati presenti nei campioni, dovrebbesono stati rilevati nei campioni hr 48 pure, ma sempre che non era il caso. Espressione sotto il controllo del promotore 35S-non è sempre uniforme; può essere influenzata dalle condizioni ambientali 50, tipo di tessuto e stadio di sviluppo 51,52. Allo stesso tempo, nel percorso di interferenza RNA, il tasso di degradazione dell&#39;mRNA e il tasso di decadimento siRNA possono variare significativamente 53. È possibile che la rapida degradazione dell&#39;mRNA dal meccanismo di interferenza RNA avrebbe potuto evitare rilevamento mRNA a 48 ore di incubazione. Se l&#39;assenza di espressione di 48 ore è stato a causa delle basse 35S-promotore guidato la trascrizione, o di veloce degrado di dsRNA da Dicer rimane da risolvere. Pertanto, l&#39;individuazione di piccoli RNA di alta sequenziamento rendimento darebbe una migliore conoscenza sui processi che avvengono attraverso RNAi 54 in questi esperimenti. Tuttavia, dato che il silenziamento dell&#39;RNA si diffonde per via sistemica, principalmente attraverso il floema da photosyntodiare fonti di saccarosio pozzi (in questo caso i semi di arachidi) 55, il silenziamento di aflatossina sintesi può verificarsi in semi senza espressione locale del RNAi dell&#39;inserto. Molta ricerca resta da fare per determinare il livello di soglia di piccoli RNA interferenti (siRNA) necessari per evitare l&#39;accumulo di aflatossine nei semi. È importante sottolineare il fatto che sia, l&#39;espressione dell&#39;mRNA del RNAi costrutto (Figura 6), e l&#39;accumulo di aflatossine B 1 e B 2 (figura 7) ha mostrato risultati diversi per immaturi (giallo) vs. maturo (marrone) cotiledoni. Piante di arachidi hanno una crescita indeterminata, cioè, essi presentano alla raccolta una serie di baccelli scadenza, figura 2. Inoltre, i semi di diversi gruppi di maturità differiscono nella loro composizione chimica, per es., 2,4% di saccarosio nei semi immaturi, e 1,9% in semi maturi sotto lo stesso condizioni di campo 56,57. Così, per capire la reale efficiency del controllo RNA-mediata di accumulazione aflatossina, è importante analizzare i gruppi di maturità separatamente. Una difesa naturale di semi di arachidi è la produzione di fitoalessine, che varia nella diversità dei composti prodotti e delle loro quantità relative a seconda della scadenza dei semi e delle condizioni ambientali 58-61, ed è particolarmente elevato negli embrioni rispetto al 62 cotiledoni. Gli embrioni hanno concentrazioni significativamente più elevati di acidi nucleici, entrambi DNA e RNA che i cotiledoni (Arias RS, non pubblicati). Come semi di arachidi maturi, cambiamenti nella loro fisiologia e composizione chimica si verificano 63. Antiossidanti fenolici in forma testa di arachidi tannini condensati con attività fungistatica 64; questo è evidente anche nel colore mesocarpo che riflette le fasi di maturità, giallo al nero 35, come il suo contenuto di tannini e composti fenolici aumenta con la maturità 65. Pertanto, la presenza di testa o embrioni nell&#39;esperimento, date le loro proprietà antimicrobiche, potrebbero hanno limitato la crescita di funghi e quindi sopravvalutato l&#39;effetto di silenziamento RNAi, di conseguenza, sono stati rimossi. Inoltre, la rimozione di testa ed embrioni aiuta limitare le fonti di variazione nell&#39;analisi, come la metà cotyledon che porta l&#39;embrione avrà più fitoalessine e più contenuti di RNA. In aggiunta alle analisi da gruppi scadenza e rimozione di testa ed embrione in questi esperimenti, è importante sottolineare qualche osservazioni: a) se i risultati sono mostrati per fino a 96 ore di incubazione, si raccomanda di usare più di 72 hr per ottenere risultati consistenti, come i semi vengono degradati da 96 ore; e b), mentre la metà cotiledoni dello stesso seme, anche se campionata a caso, non costituiscono campioni perfettamente indipendenti, RT-PCR e l&#39;accumulo di aflatossina all&#39;interno di eventi transgenici hanno dimostrato variazione minima tra i semi. Inoltre, un accurato conteggio delle spore fungine, il volume inoculos di 2 microlitri, e l&#39;applicazione di spore sulla superficie di taglio dei cotiledoni evitando gocciolamento sui lati sono importanti per assicurarsi che le spore germinati sono esposti al tessuto vegetale. L&#39;acqua / agar sulle piastre dovrebbe essere al 1,5% (w / v), agar morbido provoca deflusso di spore, come mostrato sull&#39;ultimo telaio di figura 4 (inferiore). Dovrebbe sementi disponibilità da un particolare evento transgenico essere limitato, il campionamento può essere effettuato in duplicato anziché triplicato ottenere risultati simili (ad esempio, figura 7); tuttavia, i campioni in triplicato contribuirà a ridurre l&#39;errore standard. L&#39;unica limitazione di questo metodo è che richiede un sistema altamente sensibile (UPLC) per il rilevamento aflatossina / quantificazione, ma allo stesso tempo si riduce la probabilità di sovrastimare l&#39;effetto di RNAi dovrebbe aflatossine non essere rilevato con metodi meno sensibili. In conclusione, questo metodo offre per la prima volta un approccio affidabile per studiare laeffetto RNAi nel controllo delle aflatossine. Riducendo il tempo per un esperimento da un&#39;intera stagione di ritaglio per meno di una settimana, questo metodo tremendamente accelerare la ricerca sulle RNAi-arachidi / Aspergillus patosistema verso la mitigazione e / o l&#39;eliminazione di aflatossine.

Circa 4,5 miliardi di persone sono cronicamente esposti a aflatossine 1, le più potenti agenti cancerogeni noti in natura 2. Queste micotossine contaminano il 25% delle colture alimentari del mondo 3, tra cui mais, manioca, riso, noci, cereali e spezie. 4. Le aflatossine causare arresto della crescita nei bambini di 5, compromettono il sistema immunitario 6, sono presenti nel 58% dei carcinomi epatocellulari-in biopsie umane 7,8, e uccidono centinaia di persone durante le epidemie periodiche di aflatoxicosis 9,10. Le aflatossine sono micotossine polyketide di derivazione normalmente prodotti da Aspergillus flavus e A. parasiticus; aflatossine B 1 e B 2 sono prodotte da A. flavus, mentre A. parasiticus produce anche G 1 e G 2. La struttura chimica di questi composti e un cromatogramma che mostra la loro separazione dal UPLC sono mostrati in Figura 1. </strong&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> Figura 1. Le aflatossine e RNAi inserire Top:. Struttura chimica (a sinistra) e con l&#39;esempio di cromatogramma (a destra) dei quattro aflatossine polyketide di derivazione più comuni: B 1, B 2, G 1 e G 2, prodotta da Aspergillus parasiticus, A . flavus produce B 1 e B 2 In basso: Schema di frammenti di geni nel RNAi costruire p5XCAPD utilizzato per la trasformazione di arachidi, numeri sotto le frecce sono numeri di accesso gene-frammento del genoma Aspergillus flavus;. PIV2: introne patate; coppie di basi;: bp RT_5X_1 e RT_5X_2:. Real-Time PCR Primer siti <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Le perdite economiche delle esportazioni a causa di aflatossine in arachidi solo superano $ 450 milioni di dollari, se calcolata in base al 4 ng. G -1 limite di aflatossine consentito per il consumo umano nell&#39;Unione europea 11. Le aflatossine sono note da 60 anni 12; Tuttavia, anche se molte pratiche agricole sono state sviluppate per mitigare l&#39;effetto, compresa l&#39;applicazione di altri ceppi fungini 13,14, nessun metodo coerente di controllo esiste, e varietà vegetali resistenti non sono disponibili. Test germoplasma vegetale per la resistenza di aflatossine è particolarmente difficile, perché anche in condizioni favorevoli per l&#39;agente patogeno invasione, l&#39;accumulo di micotossine è imprevedibile e non segue una distribuzione normale. Così, gli esperimenti di solito richiedono aree di impianto di grandi dimensioni, centinaia di semi e campioni multipli di 100-1,700 g per ridurre la variabilità del 15,16 dati. RNA interferenza erascoperto nel 1998 17; ed i benefici di &quot;tacere&quot; sono attualmente in fase di studio in una serie di nuove applicazioni, ad es., nelle terapie umani contro il cancro al seno metastatico 18, il cancro al fegato 19, leucemia mieloide 20, e in protezione delle piante contro gli insetti 21 e 22 nematodi. Nelle piante, segnali di disturbo RNA possono viaggiare una cella all&#39;altra, con piccoli RNA interferenti (siRNA) e alta RNA peso molecolare responsabile per il gene posttranscriptional sistemica silenziamento 23,24, anche all&#39;interno di patogeni fungini che si trovano a stretto contatto con pianta ospite 25. L&#39;efficacia di RNAi sulla pianta mediato silenziamento di geni fungini-patogeno è stata descritta in poche patosistemi vegetali, per questi, l&#39;esame visivo dei sintomi nelle parti aeree delle piante (foglie) consentita la quantificazione della malattia, vale a dire, oomicete Bremia nella lattuga 26 , Puccinia nel grano <sup&gt; 27 e Fusarium in banane 28. Molto più difficile è quello di valutare l&#39;efficacia RNAi per controllare micotossine nelle piante, in particolare aflatossine in arachidi come le foglie mostrano sintomi di infezione, gli organi invasi (semi) sono sotto parecchi pollici di suolo, l&#39;insorgenza di infezione è imprevedibile, e solo chimica analisi può determinare la presenza di aflatossine. Inoltre, ogni evento transgenico in arachidi normalmente produce alcuni semi (4-6 per pianta); Pertanto, il test tradizionale per un no-aflatossina accumulo tratto in grandi appezzamenti di campo, della durata di intere stagioni di coltivazione, e l&#39;utilizzo di centinaia di semi non è fattibile. Un metodo è descritto qui di analizzare in meno di una settimana, RNAi semi di arachidi per presenza di transgene e di un no-aflatossina accumulo tratto, utilizzando solo pochi semi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:256px;">Primers, oligonucleotides</td>
			<td style="width:127px;">DNA Technologies, Coralville, IA, USA</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Dneasy Plant Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">69106</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:256px;">Czapek Dox agar medium</td>
			<td style="width:127px;">Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">CM0095</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Agar</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">BP 1423</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Freezer -80&#176;C</td>
			<td style="width:127px;">n/a</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Aluminum Oxide, Al2O3</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A941</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">SPE Reservoirs 1.5 mL</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">210011</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Frits for 1.5 mL SPE reservoir</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">211401</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;">186005221</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="150">
			<td height="150" style="height:150px;width:256px;">Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:256px;">Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">A6636; A9887; A0138; A0263</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Systat Software 12.2</td>
			<td style="width:127px;">SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">15596-018</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11752-050</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:256px;">ABI 7500 Real-Time PCR</td>
			<td style="width:127px;">Lifetechnologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:123px;">4406984</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Luria Broth-Miller</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">R453642</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">pENTR1A</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">A10462</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11791-020</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB Biolabs</td>
			<td style="width:123px;">M0202L</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Gelrite</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">G1919</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">D134406</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:256px;">QIAcube robot workstation</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">9001292</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:256px;">Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Goldbio, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11304-029</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem

L&#39;Organizzazione per l&#39;Alimentazione e l&#39;Agricoltura delle Nazioni Unite stimano che il 25% delle colture alimentari nel mondo sono contaminati con aflatossine. Che rappresenta 100 milioni di tonnellate di cibo distrutte o dirottati verso il consumo non umano di ogni anno. Le aflatossine sono potenti agenti cancerogeni normalmente accumulati dal funghi Aspergillus flavus e A. parasiticus in cereali, noci, tuberi e altri prodotti agricoli. Silenziamento di cinque geni aflatossina-sintesi di RNA interference (RNAi) negli impianti di arachidi è stato utilizzato per controllare l&#39;accumulo di aflatossina a seguito dell&#39;inoculazione con A. flavus. In precedenza, nessun metodo esisteva per analizzare l&#39;efficacia di RNAi in arachidi singoli eventi transgenici, come questi di solito producono pochi semi e metodi tradizionali di esperimenti sul campo di grandi dimensioni in condizioni di aflatossina-favorevoli non erano un&#39;opzione. Nel campo, la probabilità di trovare semi naturalmente contaminati è spesso 1/100 a 1/1,000. Inoltre, la contaminazione da aflatossine non è distribuito in modo uniforme. Il nostro metodo si avvale di alcuni semi per evento transgenico, con piccoli pezzi lavorati per real-time PCR (RT-PCR) o piccoli RNA sequencing, e per l&#39;analisi di accumulo di aflatossina mediante cromatografia liquida ultra-prestazioni (UPLC). -RNAi esprimendo linee di arachidi 288-72 e 288-74, ha mostrato una riduzione fino al 100% (p≤0.01) in aflatossina B 1 e B 2 rispetto al controllo che si sono accumulati fino a 14.000 ng. G -1 di aflatossina B 1 quando inoculati con aflatoxigenic A. flavus. Come riferimento, il totale massimo di aflatossine consentiti per il consumo umano negli Stati Uniti è di 20 ng. G -1. Questo protocollo descrive l&#39;applicazione del controllo RNAi mediata di aflatossine nei semi e metodi per la sua valutazione di arachidi transgenici. Noi crediamo che la sua applicazione in allevamento di arachidi e altre colture porterà un rapido progresso in questo importante settore della scienza, La medicina e nutrizione umana, e contribuirà in modo significativo allo sforzo internazionale per il controllo aflatossine, e potenzialmente altre micotossine nelle principali colture alimentari.

Plasmide p5XCAPD è stato fatto come un derivato di pCAPD 29, e lo ha utilizzato per trasformare le piante di arachidi; questo vettore trasporta ripetizioni invertite di cinque piccoli frammenti, 70-80 bp ciascuna, di geni aflatossina-sintesi di A. flavus separati da un introne (Figura 1). Frammenti di AFL2G_07224 (AFLR), AFL2G_07223 (AFLS o aflJ), AFL2G_05027 (pompa di efflusso aflatossina, aflep), AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1), e AFL2G_07731 (pes1) sono stati utilizzati per la costruzione, numeri sulla figura 1 corrispondono ad A . flavus annotazione del genoma in BROAD Institute, Cambridge, MA, e la letteratura 42. Un totale di 99 linee di arachidi sono stati rigenerati dopo aver attraversato il processo di trasformazione, 50 erano positivi alla PCR per NPTII rilevato da STN-PCR, e 33 linee erano PCR semi positivi e prodotti. Solo sette linee positive PCR sono stati clonale propagate e testati dal presenMetodo t di accumulo aflatossina, tutti e sette mostrato tra il 60% e il 100% in meno di accumulo aflatossina rispetto al controllo. Qui vi mostriamo i risultati di due di queste sette linee. Come singoli eventi transgenici di solito producono pochi semi, un metodo è stato sviluppato per utilizzare un numero minimo di sementi, pur essendo in grado di fare analisi statistica parametrica. Un diagramma di flusso della preparazione del campione e la configurazione sperimentale è mostrato in Figura 5 e nella tabella 1. Anche se la prima generazione di semi transgenici è tipicamente emizigote, si prevede che la cellula-cellula e circolazione sistemica di piccoli RNA interferenti (siRNA) generata attraverso RNA interference dovrebbe conferire aflatossina sintesi silenziamento in tutto l&#39;impianto. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> Figura 5. diagramma di flusso Schema del metodo per analizzare l&#39;efficacia di RNAi in tacere </strong&gt; Aspergillus geni aflatossine-sintesi di semi di arachidi. Rappresentazione grafica del flusso di lavoro durante l&#39;elaborazione di campioni di arachidi per l&#39;espressione genica e l&#39;analisi delle aflatossine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> RNAi linee arachidi 288-72 e 288-74 hanno evidenziato la presenza del creatore selezionabile NPTII quando testato da STN-PCR, le sezioni di gel sono mostrati in figura 6 (in alto), immagini originali sono disponibili su richiesta degli autori. Plasmid pCAPD non è stato utilizzato come controllo della trasformazione poiché esso codifica ripetizioni invertite di due geni CMR (resistenza al cloramfenicolo) e CCDB (tossina) ignota effetto sulle piante. PCR negativa linea di arachidi 288-9 e altri che sono passati attraverso il processo di rigenerazione e sia stata coltivata nelle stesse condizioni linee RNAi, sono stati utilizzati come con negativocontrollo. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> . Figura 6. Individuazione di prodotti transgenici e Real Time espressione di RNAi dell&#39;inserto Top: tubo singolo, nested PCR individuazione di linee transgeniche arachidi RNAi-288-72 e RNAi-288-74, piante positivi. Controlli: W (acqua), PP (pianta positivo), MM (master mix), p (plasmide p5XCAPD); frazioni 1/2 04/01 08/01 16/01 rappresentano diluizioni 2-fold di DNA inferiore:. Real-Time PCR rilevamento di espressione del RNAi inserto (set di primer: RT_5X_1, RT_5X_2, come nella figura 1, su immaturo ( giallo) e maturo (marrone) cotiledoni di linee transgeniche a 24 e 48hr incubazione; linea grigia: C T = 1. Gli istogrammi rappresentano i mezzi e le barre di errore standard (T) su tre campioni biologicicon tre repliche tecniche. La quantificazione relativa dell&#39;inserto RNAi è stata normalizzata rispetto al gene housekeeping actina come controllo interno ed espressione volte comparativo del transgene calcolato come descritto in 5.2.2 e 5.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per testare l&#39;efficacia di pianta-host RNAi mediata controllo potenziale di accumulo di aflatossina, conidi appena raccolto di Aspergillus flavus NRRL 3357 sono stati applicati sulla superficie di taglio di cotiledoni mezzo da cui erano state rimosse embrioni e testa (figure 3, 4). A. flavus NRRL 3357, per i quali il genoma è stato sequenziato ed è stata la base per la progettazione p5XCAPD, è stato gentilmente fornito dal Dr. Horn a USDA-ARS-NPRL. L&#39;invasione fungina risultante di mezzo cotiledone dopo il 24, 48 e 72 ore a 30 ° C è spettacolo<html> n in Figura 4. Campioni di cotiledoni mezzo inoculati sono stati raccolti a 24, 48, 72, 96 ore di incubazione, e analizzati per la principale quattro aflatossine B 1, B 2, G 1 e G 2 utilizzando UPLC e confermati da LC-MS ; risultati sono mostrati in Figura 6. Alfatossina concentrazioni sono state determinate utilizzando un metodo pubblicato con modifiche 36. A 96 ore di incubazione, cotiledoni cominciano a disintegrarsi a causa della infezione fungina. RNAi linea 288-72 mostrato livelli significativamente più bassi di aflatossine rispetto al controllo in tutte le date di campionamento di cotiledoni immaturi e alla maggior parte le date di prelievo in quelli maturi. RNAi linea 288-74 ha mostrato livelli significativamente più bassi di aflatossine nella maggior parte le date di prelievo. I livelli di significatività del test di Tukey sono indicati con asterischi nel grafico di figura 7. <html> g7.jpg &quot;/&gt; . Figura 7. Le aflatossine B 1 e B 2 di cotiledoni mezzo di arachidi dopo incubazione (24, 48, 72 e 96 ore) con Aspergillus flavus controllo: semi di 288-9 linea non transgenica; RNAi: semi di RNAi-288-72 e RNAi-288-74, transgenici per RNAi p5XCAPD al silenzio cinque geni aflatossine-sintesi. (A) aflatossina B 1 a semi maturi (marrone); (B) L&#39;aflatossina B 2 semi maturi; (C) aflatossina B 1 nei semi immaturi (giallo) e (D) aflatossina B 2 nei semi immaturi. I valori medi con i corrispondenti barre di errore standard (T) di campioni biologici duplicati sono rappresentati. Differenze statisticamente significative di Tukey test *: p ≤ 0.05, **: p ≤ 0.01, ***: p ≤ 0,001.s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Nel complesso, RNAi-288-72 mostrato tutto l&#39;esperimento (24 a 96 ore di incubazione), una riduzione del 94% -100% in aflatossina B 2, e una riduzione del 90% -100% in aflatossina B 1 rispetto al controllo. RNAi-288-74 mostrato una riduzione del 63% -100% in aflatossina B 2 e il 60% di riduzione -100% in aflatossina B 1, Figura 7. Primer utilizzati per Real-Time PCR rilevamento di espressione dell&#39;inserto RNAi sono mostrati in Figura 1. Cotiledoni arachidi-seme sono stati analizzati senza embrioni, per rimuovere le difese naturali ed essere in grado di rilevare l&#39;effetto potenziale di RNAi sulla zona più esposta invasione fungina, i cotiledoni. L&#39;espressione della RNAi dell&#39;inserto rilevata nel cotiledoni immaturi (giallo) della linea 288-74 da set di primer RT_5X_1 era quattro volte sopra la C T </sub&gt; = 1 soglia del controllo negativo, e set di primer RT_5X_2 era 19 volte superiore alla soglia, il tutto a 24 ore di incubazione. Almeno tre dei cinque frammenti di geni consecutivi utilizzati nella trasformazione di arachidi, 5027, 7223 e 7228 (aflep, AFLS / aflJ e aflC / pksA, rispettivamente) sono stati rilevati mediante RT-PCR (Figura 1, 6). L&#39;espressione di inserto RNAi non è stato rilevato in cotiledoni maturi a 24 ore, o su cotiledoni maturi o immaturi a 48 ore di incubazione, figura 6 (in basso). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> Peanut Linea </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Tempo di campionamento </td><td colspan="3" style="width:192px;"> I campioni per la RT-PCR </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> I campioni per l&#39;analisi delle aflatossine (inoculato) </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Numero di semi </td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> (non inoculato) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td><td style="width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> RNAi (giallo) </td><td style="width:64px;"> 24 ore </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48 ore </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdstyle = &quot;width: 64px;&quot;&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72 ore </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Controllo </td><td style="width:64px;"> 24 ore </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> (giallo) </td><td style="width:64px;"> 48 ore </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72 ore </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Esempio di configurazione piccolo campione per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica e l&#39;accumulo di aflatossina in RNAi semi di arachidi. Analisi completa di espressione e di aflatossine per un gruppo di maturità (es., Di colore giallo), con tre tempi di campionamento (24, 48 e 72 ore) , in triplice copia, richiederebbe 4,5 semi, ogni numero uno nella tabella rappresenta la metà cotyledon.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem at JoVE.c

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Abbiamo dimostrato un metodo per l&#39;analisi delle aflatossine e espressione del transgene in semi di arachidi che contengono segnali di RNA-interferenza per il silenziamento dei geni aflatossine-sintesi nel fungo Aspergillus flavus. Controllo RNAi mediata di micotossine nelle piante non è stata segnalata in precedenza.

Controllo RNAi mediata di aflatossine in arachidi: metodo per analizzare produzione di micotossine e transgene espressione nel Peanut /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Patosistema

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

rnai-mediated-control-aflatoxins-peanut-method-to-analyze-mycotoxin

Research

JoVE Journal

Environment

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

20.8K Views.  United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service.  Abbiamo dimostrato un metodo per l'analisi delle aflatossine e espressione del transgene in semi di arachidi che contengono segnali di RNA-interferenza per il silenziamento dei geni aflatossine-sintesi nel fungo Aspergillus flavus. Controllo RNAi mediata di micotossine nelle piante non è stata segnalata in precedenza. 

Video: RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Ottimizzare le impostazioni dei gas di scarico per promuovere la crescita di microalghe in fotobioreattori tramite simulazioni al computer

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Ricerca

Ambiente

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

Una tabella soffietto Thermogradient di controllo della temperatura del suolo per la valutazione di crescita delle piante e monitoraggio processi del suolo

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric chemistry and climate. The complex production mechanisms and reaction pathways make this a challenging research topic. To address these issues, an environmental chamber, providing enough residence time and close-to-ambient concentrations of precursors for secondary organic materials, is needed. The Harvard Environmental Chamber (HEC) was built to serve this need, simulating the production of gas and particle phase species from volatile organic compounds (VOCs). The HEC has a volume of 4.7 m3 and a mean residence time of 3.4 h under typical operating conditions. It is operated as a completely mixed flow reactor (CMFR), providing the possibility of indefinite steady-state operation across days for sample collection and data analysis. The operation procedures are described in detail in this article. Several types of instrumentation are used to characterize the produced gas and particles. A High-Resolution Time-of-Fight Aerosol Mass Spectrometer (HR-ToF-AMS) is used to characterize particles. A Proton-Transfer-Reaction Mass Spectrometer (PTR-MS) is used for gaseous analysis. Example results are presented to show the use of the environmental chamber in a wide variety of applications related to the physicochemical properties and reaction mechanisms of organic atmospheric particulate matter.

This paper describes operation procedures for the Harvard Environmental Chamber (HEC) and related instrumentation for measuring gaseous and particle species. The environmental chamber is used to produce and study secondary organic species produced from the organic precursors, especially related to atmospheric organic particulate matter.

Produzione e misurazione del particolato organico nella camera ambientale di Harvard

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

La prova di infezione di pianta: Spray e ferita-mediata di inoculazione con la pianta patogeno Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

Valutare le capacità di rimozione del particolato di albero foglie

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Visualizing Efficacy of Pesticides Against Disease Vector Mosquitoes in the Field

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform across ecological zones. To best protect public and veterinary health from these insects, the environmental limitations of pesticides need to be investigated to inform effective use of the most appropriate pesticide formulations and techniques. We have developed a research program to evaluate combinations of pesticides, pesticide application equipment, and application techniques in hot-arid desert, hot-humid tropical, warm and cool temperate, and urban locations to derive pesticide use guidelines specific to target insect and environment. To these ends we designed a system of protocols to support efficient, cost-effective, portable, and standardized evaluation of a diverse range of pesticides and equipment across multiple environments. At the core of these protocols is the use of an array of small cages with colony-reared sentinel mosquitoes (adults and immatures) and sand flies (adults), strategically arranged in natural habitats and exposed to pesticide spray. Spatial and temporal patterns of pesticide efficacy are derived from percent mortality in sentinel cages, then mapped and visualized in a geographic information system. Maps of sentinel mortality data may be statistically compared to evaluate relative efficacy of a pesticide across multiple environments, or to study multiple pesticides in a single environment. Protocols may be modified to accommodate a variety of scenarios, including, for example, the vertical orientation of sentinels in canopy habitats or simultaneous testing of ground and aerial application methods.

The efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects is not uniform across different ecological zones. Here we present a system of techniques using captive vector insects as sentinels for pesticide efficacy to derive electronic maps supporting the standard evaluation of pesticides across multiple environments.

Efficacia dei pesticidi contro le zanzare vettore di malattia nel campo di visualizzazione

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Composizione e analisi della distribuzione di Bioaerosols in diverse condizioni ambientali

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&ndash;Environment Interactions

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating a knowledge gap. To meet the challenge of improving crops to feed the growing global population, this gap must be bridged.
Physiological traits are considered key functional traits in the context of responsiveness or sensitivity to environmental conditions. Many recently introduced high-throughput (HTP) phenotyping techniques are based on remote sensing or imaging and are capable of directly measuring morphological traits, but measure physiological parameters mainly indirectly.
This paper describes a method for direct physiological phenotyping that has several advantages for the functional phenotyping of plant&#8211;environment interactions. It helps users overcome the many challenges encountered in the use of load-cell gravimetric systems and pot experiments. The suggested techniques will enable users to distinguish between soil weight, plant weight and soil water content, providing a method for the continuous and simultaneous measurement of dynamic soil, plant and atmosphere conditions, alongside the measurement of key physiological traits. This method allows researchers to closely mimic field stress scenarios while taking into consideration the environment&#8217;s effects on the plants&#8217; physiology. This method also minimizes pot effects, which are one of the major problems in pre-field phenotyping. It includes a feed-back fertigation system that enables a truly randomized experimental design at a field-like plant density. This system detects the soil-water-content limiting threshold (&#952;) and allows for the translation of data into knowledge through the use of a real-time analytic tool and an online statistical resource. This method for the rapid and direct measurement of the physiological responses of multiple plants to a dynamic environment has great potential for use in screening for beneficial traits associated with responses to abiotic stress, in the context of pre-field breeding and crop improvement.

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&amp;#8211;Environment Interactions

This high-throughput, telemetric, whole-plant water relations gravimetric phenotyping method enables direct and simultaneous real-time measurements, as well as the analysis of multiple yield-related physiological traits involved in dynamic plant&#8211;environment interactions.

Una piattaforma telemetrica e gravimetrica per la fenotipizzazione fisiologica in tempo reale delle interazioni pianta-ambiente

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating ...

Mistletoe Eradicator - A Novel Tool for Simultaneous Mechanical and Chemical Control of Mistletoe

Some species of mistletoes, an aerial plant hemiparasites, play a Janus-like role in ecosystems by being rich biodiversity hotspots due to their trophic and topic associations with various organisms and at the same time acting as biological pirates, exhausting the host trees by stealing water and nutrients via the haustorium. Many crop and timber trees are attacked by mistletoes, for example, dwarf mistletoes parasitize conifers, representatives of genus Tapinanthus target guava, and Phoradendron mistletoe target pecans. Recently, an increasing infestation of the European mistletoe (Viscum album subsp. album L.) in monoculture stands of common walnuts (Juglans regia L.)&#160;was recorded for the first time during 2018 in different regions of Kashmir Valley, India. The common chemical approach based on the spraying of mistletoe exophytes with the growth regulators, ethephon and glyphosate, was not efficient since V. album resprouted in the next vegetation season. Hand pruning of mistletoe was time-consuming, and a polyethylene covering resulted in the localized rotting of host tissues. The most efficient approach to eradicate mistletoe was the use of a novel tool called Mistletoe Eradicator, which allows to use mechanical and chemical means of mistletoe control simultaneously. It consists of a manipulating pole with the terminal pruning saw having a container filled with the growth regulator, from which the liquid slowly drops onto the saw blade through the nozzle. It allows working both from the ground and in the tree canopy. After the targeted application of 5%-10% ethephon or glyphosate to the base of the just pruned V. album stems (stubs), exophyte resprouting was significantly reduced 9 months after the pruning as compared to the only pruned or sprayed exophytes. An alternative variant of Mistletoe Eradicator was constructed in Ukraine filled just with a food color additive to track the liquid dropping and was successfully tested.

The protocol describes an easy-to-handle tool called Mistletoe Eradicator which combines mechanical and chemical approaches and is efficient in the control of mistletoe infestation on the host trees. The manuscript uses the European mistletoe (Viscum album subsp. album L.) as an example.

Mistletoe Eradicator - Un nuovo strumento per il controllo meccanico e chimico simultaneo del vischio

Some species of mistletoes, an aerial plant hemiparasites, play a Janus-like role in ecosystems by being rich biodiversity hotspots due to their trophic ...