Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) e il Fondo di ricerca Anemia di Fanconi.

1. Preparazione di Dig-TMP <ol><li> Mescolare 50 mg (0,18 mmoli) di 4&#39;-clorometil-4,5&#39; , 8-trimethylpsoralen e 590 mg (2,7 mmoli) di 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-ammina in 25 mL asciutto rotondo pallone -bottom sotto azoto. Aggiungere 10 ml di toluene e riflusso per 12 ore. Rimuovere il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta. <ol><li> Purificare il residuo da cromatografia flash su colonna su gel di silice. Eluire la colonna con cloroformio, metanolo, e la soluzione di ammoniaca al 28% (9: 1: 0,5). Evaporare il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta, e recuperare il puro 4 &#39;- [N- (13-ammino-4,7,10-trioxatrideca)] amminometil-4,5&#39;, 8-trimethylpsoralen come giallo paglierino viscoso liquido. </li><li> Mescolare 5,5 mg (0,012 mmoli) di 4 &#39;- [N- (13-ammino-4,7,10-trioxatrideca)] amminometil-4,5&#39;, 8-trimethylpsoralen con 5 mg (0,008 mmoli) di estere NHS in digossigenina asciutto pallone a fondo tondo sotto azoto. Aggiungere 0,5 ml di dimetil formammide anidra (DMF) und 3.4 ml di trimetilammina e agitare a 50 ° C per 18 h. </li><li> Rimuovere il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta. </li><li> Sciogliere il residuo in quantità minima di diclorometano. Applicare la soluzione in 2 punti uL orizzontalmente lungo la parte inferiore di una piastra preparativa su strato sottile di gel di silice come fase stazionaria. Eseguire il TLC preparativa in cloroformio: metanolo: ammoniaca 28% (8: 1: 0,1). </li><li> Mascherare la piastra tranne per i bordi verticali e identificare la banda di prodotto con lunghezza d&#39;onda corta UV 254 nm lampada. Raschiare il prodotto dalla piastra con una spatola e isolare il prodotto puro con cloroformio: metanolo: idrossido di ammonio 28% (8: 1: 0,1) miscela. </li><li> Rimuovere solventi in evaporatore rotante sotto pressione ridotta. Sciogliere il pellet residuo in 1 ml di 50% EtOH: H 2 O, dispensare in aliquote di 50 microlitri in provette da 1,5 mL (~ 20 Aliquote) e secco in un evaporatore centrifugo finché tutto il solvente è evaporato (~ 3 h). </li><li>Riprendere ciascuna aliquota in 200 microlitri di 50% EtOH: H 2 O e asciugare nuovamente in un evaporatore centrifugo. Sciogliere ciascuna aliquota di nuovo in 200 ml di 50% EtOH: H 2 O, secco in un evaporatore e conservare centrifughe pellet a -20 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol></li><li> Per l&#39;uso, sciogliere il precipitato in 50 ml di 50% EtOH: H 2 O. Preparare una diluizione 1: 100 del disciolto Dig-TMP in H 2 O e misurare OD a 250 nm. Il coefficiente di estinzione di Dig-TMP è 25.000. La soluzione è stabile per circa un mese se conservato a -20 ° C. Verificare la concentrazione misurando OD a 250 nm prima di ogni uso. <ol><li> Calcola concentrazione stock: Abs x 100 x10 6 / 25.000 = concentrazione (in micron). In genere la soluzione di riserva è di circa 3 mm. È importante essere in questo intervallo per ridurre al minimo il volume di EtOH aggiunto al mezzo. </li></ol></li></ol> 2. Laser localizzati Dig-TMP ICL <ol><li> Perform localizzazione laser con un microscopio confocale con un laser ad azoto SRS (337 nm) pompato attraverso una cella colorante che emette una linea di 365 nm e cottura 3 ns impulsi a 10 Hz, con una potenza di 0,7 nW. </li><li> Fare un segno verticale sul lato di un vetro 35 millimetri a fondo piatto di coltura cellulare con un pennarello. Graffiare il cross al centro del vetro sulla superficie cultura con una penna diamante tale che la striscia nera sul lato del piatto è nella parte superiore di un braccio della croce. La croce è segnata sulla superficie di crescita del vetro in modo che le cellule e sarà nello stesso piano focale. </li><li> Sterilizzare la piastra dopo marcatura con un risciacquo di 70% EtOH. Asciutto prima placcatura le cellule. </li><li> cellule piastra (ceppi di laboratorio standard come HeLa o U2OS) nella croce assegnati in piatti di coltura di uno o due giorni prima. Cellulare dovrebbe essere attivamente dividendo e il 50-70% confluenti il ​​giorno dell&#39;esperimento. Incubare 24 h con 1 uM 5-cloro-2-deossiuridina (CldU) per DNA etichetta uniformemente. </li><li> InserisciDig-TMP in 50% EtOH: H 2 O per mezzo di coltura cellulare ad una concentrazione finale di 20 pM. Portare il mezzo a 37 ° C. Cambiare il mezzo sulle cellule e posto in incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per 30 min per permettere il Dig-TMP equilibrare. </li><li> Mentre le cellule sono incubando, stabilire le coordinate x / y del campo visivo in cui il laser è attivo. Seguire la procedura di calibrazione del produttore, in cui il laser è diretto dal software per incidere un vetrino a specchio lungo una linea orizzontale e diagonale. Le due linee definiscono i confini del campo in cui il laser può colpire un bersaglio. </li><li> Si pone la placca nella camera ambientale, a 37 ° C con controllata CO 2 ed umidità, sul palco microscopio e mettere a fuoco con l&#39;obiettivo 60X olio sulla intersezione della croce. </li><li> Dirigere il fascio laser 365 nm ad una ROI, stabilita dallo sperimentatore con lo strumento forma nel software, per formare una striscia di 3 &amp;# 181; mx 0,6 micron. Il contorno della ROI viene collocata dal cursore in nuclei delle cellule situate nelle immediate vicinanze dell&#39;intersezione della croce. Regolare il piano focale z per indirizzare la metà laser attraverso il nucleo. Utilizzare un laser nel range di 350-370 nm. 405 nm laser non possono indurre reticolazioni 19. NOTA: Noi individuare il ROI nelle zone nucleoplasmic fuori della nucleoli, che può essere distinto da nucleoplasm in contrasto interferenziale differenziale (DIC) imaging. </li><li> Verificare il focus e l&#39;attività del laser, aumentando l&#39;impostazione di potenza ad un livello sufficiente per cancellare una cella (la cella si scurisce e quindi scompaiono). Questo è un importante diagnostico per un percorso ottico senza ostacoli per il laser attraverso il microscopio e poi attraverso il vetrino e nelle cellule. <ol><li> Abbassare l&#39;impostazione della potenza di appena sufficiente per attivare il psoraleni e l&#39;ICL indotta DDR (questo deve essere determinato empiricamente per ogni laser / microfonoROSCOPE combinazione). Utilizzare un&#39;intensità del laser impostazione (1,7% qui) che non attiva il DDR in assenza di psoralene (monitorato dalla formazione di γ-H2AX). NOTA: Questa è una determinazione importante e le impostazioni possono richiedere una regolazione se la sorgente laser o di un componente nel percorso ottico è cambiato. Seguire l&#39;accumulo di GFP tag proteine ​​di riparazione come XPC o FAN1, entrambi i quali sono rapidamente reclutati (in secondi) alle strisce psoraleni laser, ma non al ROI esposto al solo laser. Alcune proteine ​​del DDR appaiono in pochi secondi, mentre diversi minuti possono essere richiesti per gli altri. E &#39;necessario effettuare determinazioni corso di tempo per ogni proteina di interesse. Si segnala altresì che in cellule che non sono stati esposti al laser non ci sono strisce di proteine ​​rispondere. </li></ol></li><li> Dopo che tutte le celle in un campo sono stati indirizzati spostare la piastra in un campo, rimanendo vicino alla intersezione della croce. </li><li> Negli esperimenti progettati per determine la distribuzione delle distanze tra l&#39;lesione esporre cellule al laser in 20-25 campi (4-5 cellule / campo) intorno all&#39;intersezione. Al fine di analizzare i modelli di replica in prossimità delle ICL localizzate incubare le cellule con 10 micron 5-iodo-2-deossiuridina (IDU) dopo la cottura del laser. NOTA: Il tempo di incubazione con Idu è un po &#39;arbitraria. Abbiamo usato il più corto di 20 minuti e fino a 60 minuti (vedi sotto). impulsi più lunghi (poche ore) spesso sfociano in molteplici tratti di replica coalescenza, perdendo così l&#39;opportunità di immagine il progresso di singole forcelle. In alcuni esperimenti ces sono etichettati con CldU per 24 ore in maniera uniforme DNA etichetta prima dell&#39;esposizione a Dig-TMP seguita da etichettatura impulso di tratti di replica. </li></ol> 3. Raccolta di cellule e di fibre Stretching DNA <ol><li> Rimuovere la piastra dal palco, rimuovere il terreno, e lavare con tampone fosfato (PBS). Rimuovere la soluzione PBS. Mettere una goccia 10 ml di un tripsina commerciale/ EDTA sulla intersezione della croce al centro della superficie del vetro. </li><li> Incubare per 3-4 minuti a temperatura ambiente (RT) e quindi disegnare la soluzione di tripsina con le cellule staccate nella punta della pipetta. Non v&#39;è alcuna necessità di neutralizzare la tripsina. </li><li> Posizionare la goccia di tripsina / EDTA con le cellule ad un&#39;estremità di un silanizzata vetrino per microscopio. Lisare le cellule e rilasciare il DNA mediante aggiunta di 10 ml di soluzione 0,5% SDS e incubare per 3-4 minuti a temperatura ambiente mescolando delicatamente con la punta della pipetta, consentendo la periferia della piscina ad asciugare. </li><li> Inclinare il vetrino 20 ° e consentire al liquido di scorrere fino alla fine. Le fibre di DNA vengono estesi / allungato dalle forze idrodinamiche del liquido che scorre. Lasciare asciugare i vetrini all&#39;aria (~ 10 min) e fissare in 3: 1 metanolo / acido acetico per 10 min. Rimuovere i vetrini dalla soluzione correzione e l&#39;aria secca di nuovo. A questo punto si possono conservare indefinitamente in 70% EtOH a -20 ° C. Rimozione dal EtOH 70% lasciare asciugare all&#39;aria prima della nestep xt. </li><li> Lavare i vetrini in PBS, e quindi denaturate in 2.5 M HCl per 1 ha RT. Questo trattamento depurinates messa nucleobasi alogenati incorporate accessibili agli anticorpi DNA. </li><li> Neutralizzare i vetrini in 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Lavare due volte in PBS / 0.5% Tween-20 (PBST) per 5 minuti ciascuna. </li><li> Blocco vetrini con 5% di albumina sierica bovina (BSA) e 10% siero di capra in PBS. Coprire i vetrini delicatamente con un parafilm per diffondere la soluzione di saturazione uniformemente sul vetrino e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare 100 ml di 1: 200 diluizione in soluzione bloccante di ratto anti-bromodeossiuridina (rileva specificamente CldU) anticorpo primario per ogni diapositiva. Coprire i vetrini delicatamente con un parafilm per diffondere la diluizione uniformemente sul vetrino e incubare in una camera umidificata per 1 ha RT. Rimuovere il parafilm e lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuna. </li><li> Pipettare 100 ml di diluito (1: 100) di capra anti-topo Alexa Fluor 647 in soluzione bloccante per ogni diapositiva. coprire ilscivola delicatamente con un parafilm e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuno. </li><li> Pipettare 100 ml di diluito (01:40) topo anti-bromodeossiuridina (rileva ldu e CldU Questa doppia specificità richiede il blocco CldU dal ratto contro BrdU in incubazione precedente.) Anticorpo primario e coniglio anti-DIG anticorpi (1: 200 ) in soluzione bloccante per ogni diapositiva. Coprire i vetrini delicatamente con un parafilm e incubare in una camera umidificata per 1 ha RT. Lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuno. </li><li> Dispensare 100 ml di diluito (1: 100) capra anti-topo Alexa Fluor 488 ec (1: 5.000) sonda anti-coniglio di capra (ad esempio, Qdot 655) in soluzione bloccante per ogni diapositiva. Coprire i vetrini delicatamente con parafilm e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuno. </li><li> Drenare eccesso PBST su un tovagliolo di carta. Aggiungere 50 ml di antifade mezzo di montaggio su ciascun vetrino e coprire con un coprioggetto. Immagine o negozio pernon più di 48 ore a -20 ° C. </li></ol> 4. Imaging fibra da microscopia a fluorescenza <ol><li> Eseguire l&#39;acquisizione di immagini attraverso un obiettivo 63X su un microscopio invertito con annessa ruota portafiltri completamente motorizzato con FITC, Cy5 e Q Dot 655 rilevamento. Il filtro di eccitazione è 425 nm, e il filtro di emissione è 655 nm con 20 nm centrata in corrispondenza del picco di emissione 20. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La tecnologia di localizzazione laser richiede l&#39;uso di cellule aderenti con nuclei che sono visibili in microscopia in campo chiaro. Abbiamo cercato di attaccare le cellule non aderenti, quali linfociti primari o cellule coltivate debolmente aderenti come AD293, alla superficie di vetro con preparazioni adesive cella come polilisina o collagene, o miscele più complesse. Anche se questi trattamenti possono legarsi alle cellule di superficie, troviamo che essi rimangono generalmente arrotondata che rende molto diffi...

DNA è sotto costante aggressione dagli agenti esogeni come radiazione, luce ultravioletta, tossine ambientali, prodotti di combustione, ecc Inoltre, è attaccato anche da specie radicaliche endogene prodotte dal metabolismo ossidativo. Tutti questi hanno il potenziale di distruggere chimicamente o fisicamente l&#39;integrità del DNA 1. Perturbazioni nel genoma possono attivare la risposta al danno del DNA (DDR), un reclutamento e post traslazionale modifica a cascata con centinaia, se non migliaia, di proteine ​​e microRNA coinvolti nella riparazione della lesione, regolazione del ciclo cellulare, apoptosi, senescenza e vie infiammatorie 2. La maggior parte delle nostre informazioni sulla DDR viene da studi con DSB. Ciò è in gran parte a causa della disponibilità di tecnologie per introdurre le pause, comprese le pause sequenza specifica, nel DNA genomico nelle cellule viventi 3. Inoltre, il propensity di pause per indurre foci di proteine ​​DDR, che possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza, è stato molto utile per identificare la cinetica ei requisiti di proteine ​​rispondere. Una delle tecnologie chiave per lo studio della DDR è stato introdotto da Bonner e colleghi, che ha usato un raggio laser per dirigere una striscia di DSB in una &quot;regione di interesse&quot; (ROI) nei nuclei delle cellule viventi 4. In effetti, hanno creato un lungo fuoco in cui le proteine ​​del DDR potevano essere identificati mediante immunofluorescenza. Ciò è stato illustrato dalla loro dimostrazione della forte banda di fosforilata H2AX istone (γ-H2AX) nelle cellule esposte laser. Da allora, l&#39;approccio laser è stata impiegata in numerosi studi della DDR indotti da DSBs. Anche se potente e popolare, e la fonte di immagini di immunofluorescenza drammatiche, va notato che nella maggior parte degli esperimenti l&#39;intensità del laser viene regolata in modo da produrre risultati osservabili, senza preoccupazione per l&#39;identità della lesione,densità, o spaziatura. In effetti, può essere difficile fare queste stime. Così essi sono in gran parte ignorati, nonostante la molteplicità delle lesioni introdotte nel DNA da laser 5. Ciò contribuisce a molte contraddizioni nella letteratura 6. In contrasto DSB, la maggior parte delle modificazioni chimiche del DNA non stimolano la formazione di foci discreta di proteine ​​DDR. Questo è importante alla luce della nostra attuale comprensione delle frequenze lesione. È stato stimato che le cellule umane in coltura incorrere ben 50 DSBs per ciclo cellulare, formati principalmente durante la fase S 7, 8, 9. Meno sono formate in cellule non proliferanti. Ciò contrasta con il numero di perdite nucleobase o eventi di modifica, che sono nell&#39;ordine delle decine di migliaia per cellula / giorno 1, 10. Così, sappiamo di più diDDR indotta da eventi che sono relativamente rare, e molto meno di quelli indotti dalla elica distorsione lesioni, che complessivamente sono molto più comuni. Per affrontare domande circa la risposta cellulare al modificazioni covalenti di DNA genomico, abbiamo voluto lavorare con un&#39;elica distorcere addotto del DNA che ha avuto l&#39;attività DDR induzione intrinseca. Inoltre, per facilitare la progettazione sperimentale e interpretazione che sono interessati una struttura la cui introduzione potrebbe essere controllato rispetto al tempo ed era suscettibile di visualizzazione. Di conseguenza, abbiamo sviluppato una strategia basata su psoraleni. Psoraleni sono ben caratterizzati intercalanti del DNA fotoattivi favorendo 5&#39; TA: AT siti. A differenza di altri agenti reticolanti quali mostarde azotate e mitomicina C (MMC) non sono DNA reattivi meno esposta a onde lunghe luce UV (UVA). Le molecole intercalate reagiscono con basi timina su filamenti opposti per produrre elica distorsione reticolazioni interstrand (ICL) 11. Con la psoralen trimetil utilizzato nei nostri esperimenti maggior parte dei prodotti sono ICL, relativamente pochi monoadducts vengono generati (meno del 10%), 12 e reticola intraelicoidali tra basi adiacenti su un filo non si formano. Perché sono potenti blocchi di replicazione e la trascrizione, psoraleni e altri agenti di reticolazione, come cis-platino e MMC, sono comunemente utilizzati in chemioterapia. Così psoralen abilitato studi che hanno seguito l&#39;attivazione del DDR da una struttura distorsione elica, e anche fornito informazioni sulla risposta cellulare ad un composto con importanza clinica. Abbiamo sintetizzato un reagente in cui trimetil psoraleni era legato alla digossigenina (DIG), uno steroli vegetali non trovato nelle cellule di mammifero e spesso usato come immunotag. Il requisito di fotoattivazione consente localizzazione dalla luce laser (365 nm) di ICLs psoraleni in ROI definita nei nuclei nelle cellule viventi. Questi possono essere visualizzati immunofluorescence contro il tag Dig. La riparazione del DNA e le proteine DDR apparsi nelle strisce di laser localizzati ICL 13, 14. DDR attivato dalle intensità laser elevate utilizzate per produrre DSB potrebbe essere causa di danni isolati o cluster 15, 16. Di conseguenza, la pertinenza dei risultati di questi esperimenti presenti in natura, lesioni presenti a concentrazioni molto più basse, è incerto. Per far fronte a domande simili sulla frequenza addotto psoraleni e spaziatura in DNA, abbiamo approfittato della tecnologia in fibra DNA 17 e puntini immunoquantum. punti quantici sono molto maggiori coloranti fluorescenti e non sono sbiancati dall&#39;esposizione alla luce. Così essi sono spesso utilizzati per l&#39;imaging singola molecola 18, un&#39;applicazione per cui coloranti fluorescenti sono sufficientemente brillante. fibre di DNA individuali possono essere allungati su gscivoli lass e possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza contro analoghi nucleosidici incorporati durante l&#39;incubazione prima alla cella raccolto. Abbiamo trattato cellule con Dig-psoralene e esposti ROI fino micro laser irradiazione. Fibre sono state preparate dalle cellule e singoli addotti Dig-psoralene potrebbe essere visualizzato con i puntini immunoquantum. Esponendo le cellule ad analoghi nucleosidici per tempi relativamente brevi (20-60 min) permette la visualizzazione dei tratti di replica in prossimità del laser localizzato ICL.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digoxigenin NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11333054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloro-psoralen</td>
			<td>Berry and Associates</td>
			<td>PS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diaminoglycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>369519</td>
			<td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates</td>
			<td>Analtech, Inc.</td>
			<td>P02511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flass glass column 24/40, 100ml</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CG-1196-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>With Volocity Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropoint Galvo&#160;</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with a Nitrogen pulsed laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dye cell</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-2250-2-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 dye</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-27-365-DYE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>New Comer Supply</td>
			<td>Part # 5070</td>
			<td>New Silane Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti BrdU antibody (IdU)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>1 in 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti BrdU Antibody (CldU)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td>1 in 200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti Dig antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>710019</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q-11421MP</td>
			<td>1 in 5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647- goat anti Rat IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488-goat anti mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-545-166</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss epifluorescent microscope A200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>&#160;with Axiovision software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>39107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule analysis of laser localized psoralen adducts

La risposta al danno del DNA (DDR) è stato ampiamente caratterizzato in studi di rotture dei filamenti doppi (DSB) indotta dal laser micro irradiazione con fascio di cellule vive. DDR a Helix distorsione modificazioni covalenti DNA, tra interstrand legami crociati DNA (ICL), non è così ben definita. Abbiamo studiato la DDR stimolato da ICL, localizzato dalla fotoattivazione laser di psoraleni immunotagged, nei nuclei delle cellule vive. Per affrontare domande fondamentali sulla distribuzione addotto e incontri replica forcella, abbiamo combinato localizzazione laser con altre due tecnologie. fibre di DNA sono spesso utilizzati per visualizzare l&#39;avanzamento delle forche di replicazione mediante immunofluorescenza di analoghi nucleosidici, incorporati durante impulsi brevi. puntini Immunoquantum sono stati ampiamente utilizzati per l&#39;imaging singola molecola. Nel nuovo approccio, fibre di DNA da cellule portatrici laser localizzato ICLs sono distribuite su vetrini da microscopio. Le targhette ICL vengono visualizzati con punti immunoquantum e the distanze tra le lesioni determinate. collisioni replica forcella con ICL possono essere visualizzati e diversi modelli incontro identificate e quantificate.

Localizzate Dig-TMP (Figura 1A) ICLs laser possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza contro la Dig-tag collegato al psoraleni. Anche se il laser può essere diretto a colpire in un&#39;area di qualsiasi contorno, le strisce non sono forme &quot;naturali&quot; nelle cellule, e segnali legittimi possono essere facilmente distinguibili da artefatti dovuti al legame non specifico degli anticorpi primari o secondari. Questa funzione è utile quando si utilizzano...

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Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand.

Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

single-molecule-analysis-of-laser-localized-psoralen-adducts

Research

JoVE Journal

Genetics

6.6K Views.  National Institute on Aging, National Institutes of Health.  I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand. 

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Ricerca

Genetica

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

L&#39;analisi metagenomica di insilato

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

Utilizzando In Vitro e nelle celle di forma per indagare la piccola molecola ha indotto cambiamenti strutturali Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.