Questo protocollo richiede l'uso di un singolo gradiente di densità che lo rende significativamente meno laborioso e più conveniente rispetto ai metodi di isolamento degli isolotti convenzionali più complessi. Il principale vantaggio di questo protocollo è che l'enzima viene consegnato direttamente al pancreas con conseguente miglioramento della digestione dei tessuti e aumento della resa dell'isolotto. Iniziare toccando gli arti del topo in posizione supina e spruzzando il corpo con il 70% di etanolo.
Utilizzando forcep in coverglass e forbici chirurgiche curve, fare un'incisione addominale orizzontale della pelle di circa tre centimetri e aprire la pelle per esporre la parete addominale. Fai un'incisione verticale da tre a quattro centimetri sul peritoneo addominale per esporre completamente il pancreas e posizionare il topo sotto un microscopio sezionante. Spingere il lobo epatico in modo superiore per esporre il condotto biliare che appare come un tubo rosa pallido e spostare delicatamente l'intestino dalla regione lombare destra e iliaca a destra della cavità addominale per esporre il condotto biliare e l'arteria epatica.
Utilizzare le micro sirifine Schwartz per bloccare attentamente il condotto biliare comune il più vicino possibile al fegato e identificare l'ampolla di Vater che si trova nella papilla duodenale e formata dall'unione del condotto pancreatico e del condotto biliare comune. Utilizzando micro pinzetta Adson per tirare il comune condotto biliare insegnato, inserire un ago da 30 gauge da mezzo pollice attaccato a una siringa da tre millilitri contenente tre millilitri di soluzione di collagenasi P appena preparata nell'ampolla di Vater spingendo l'ago nel condotto parallelo al vaso per circa un quarto della lunghezza del vaso. Una volta che l'ago è in posizione, stabilizzare l'ago con micro pinzette Adson e iniettare lentamente e costantemente tre millilitri di soluzione di collagenasi P nel condotto.
L'iniezione è considerata efficace se le regioni della testa, del collo, del corpo e della coda del pancreas sono completamente gonfiate. Il corretto ingresso nell'ampolla e la cannulazione del condotto biliare comune sono fondamentali per un raccolto di digestione di successo. Perforare le pareti duttali riduce l'efficacia dell'isolamento.
Utilizzando forcep curve e micro Adson, estrarre con cura il pancreas gonfiato partendo dalla milza e proseguendo verso lo stomaco e lungo il duodeno. Quindi posizionare il pancreas in un tubo di digestione da 50 millilitri contenente tre millilitri di soluzione di collagenasi P ghiacciata. Per raccogliere gli isolotti, utilizzare prima le forbici chirurgiche fini per tagliare il pancreas per tre o cinque secondi prima di posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius a 100-120 rotazioni al minuto per 12-13 minuti.
Al termine dell'incubazione, agitare delicatamente il tubo per circa 30 secondi per interrompere il tessuto fino a quando la soluzione non è omogenea come confermato da particelle di tessuto pancreatico fini simili alla sabbia. Non appena il tessuto viene digerito, posizionare il tubo sul ghiaccio e aggiungere 40 millilitri di soluzione di arresto freddo del ghiaccio per terminare la reazione enzimatica. Dopo aver delicatamente interrotto il pellet, far girare il tessuto digerito in una centrifuga a secchio oscillante seguita da due centrifugazioni con 20 millilitri di soluzione di arresto fresco per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, rimescolare il pellet in 40 millilitri di HBSS ghiacciato per tre lavaggi aggiuntivi, rimescolando il pellet in cinque millilitri di soluzione gradiente di densità di temperatura ambiente dopo l'ultimo lavaggio. Vortice il tubo brevemente a bassa velocità fino a quando la soluzione non viene omogeneizzata prima di aggiungere altri cinque millilitri di gradiente di densità di temperatura ambiente al tubo. Ora usa una pipetta da 10 millilitri per aggiungere delicatamente e lentamente 10 millilitri di HBSS a temperatura ambiente al tubo in modo drop-wise per consentire la formazione di un gradiente e utilizzare una centrifuga a secchio oscillante per isolare le popolazioni cellulari per separazione del gradiente di densità.
Al termine della centrifugazione, utilizzare una pipetta da 10 millilitri pre-bagnata con HBSS freddo per raccogliere da cinque a 10 millilitri dello strato di isolotto tra il gradiente di densità e l'HBSS. Trasferire gli isolotti in un nuovo tubo da 50 millilitri contenente 20 millilitri di HBSS freddo ghiaccio fresco e raccogliere le cellule centrifugando in una centrifuga a secchio oscillante. Aspirare con cura tutti tranne gli ultimi tre millilitri del supernatante senza disturbare il pellet e lavare gli isolotti almeno altre tre volte con 20 millilitri di HBSS fresco per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il supernatante con quattro millilitri di 37 gradi Celsius RMPI 1640 medio e ruotare delicatamente il tubo per rimuovere il pellet. Versare immediatamente gli isolotti in una piastra di Petri da 100 millimetri e lavare il tubo con cinque millilitri di mezzo RPMI 1640 fresco per raccogliere eventuali isolotti rimanenti che raggruppano il lavaggio con gli altri isolotti. Quindi utilizzare un microscopio a dissezione e una punta di pipetta da 20 microlitri per raccogliere isolotti dorati sferici o oblunghi sani con una superficie liscia dalla piastra di Petri per il trasferimento in una nuova piastra di Petri contenente 10 millilitri di mezzo RPMI 1640 completo.
Una volta raccolti tutti gli isolotti, posizionare gli isolotti in un incubatore sterile a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica nell'aria umidificata durante la notte. Buoni isolotti sani sembrano avere una forma rotonda liscia mentre gli isolotti danneggiati cattivi mostrano bordi ruvidi. Il tessuto esocrina non digerito è traslucido nell'aspetto e dimostra una forma irregolare.
Una corretta cannulazione e distribuzione dell'enzima collagenasi P può essere confermata da un'inflazione della porzione splenica del pancreas. L'incubazione notturna in mezzi a basso contenuto di glucosio può innescare gli isolotti per un saggio di secrezione di insulina stimolato dal glucosio il giorno seguente consentendo di comprendere la capacità secretoria dell'insulina degli isolotti.
