Questo metodo ha risposto a domande chiave sul campo, come come generare un modello di topo chimerico epatico umano, ipercolesterolemia familiare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di eseguire test antidroga in vivo. Questa tecnica ha syndication per i trattamenti dell'ipercolesterolemia familiare.
Come nuova terapia per questa malattia, può essere testato utilizzando tali modelli animali chimerici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'ipercolesterolemia familiare, può anche essere applicato ad altre malattie epatiche ereditarie. 24 ore prima dell'innesto, scongelare 40 microlitri di matrice extracellulare per topo, posizionandoli in una ghiacciaia, in una stanza fredda.
Raffreddare una siringa per insulina per ogni topo da iniettare e una scatola di 200 punte di microliter in un frigorifero di quattro gradi Celsius. Un'ora prima dell'innesto, riscaldare l'enzima di dissociazione cellulare, integrato con 50 microgrammi per millilitro di DNAasi 1, a temperatura ambiente e posizionare RPMI 1640 medium, integrato con sostituzione del siero al 20% sul ghiaccio. Scatta immagini di contrasto di fase di iHeps per registrarne lo stato, tra cui morfologia cellulare, crescita e densità cellulare.
Successivamente, lavare ogni pozzo di iHeps con 2 millilitri di PBS privo di ioni di calcio e magnesio a temperatura ambiente due volte e quindi aggiungere un millilitro dell'enzima di dissociazione cellulare preriscaldato ad ogni pozzo. Riportare le cellule nell'incubatrice per otto o dieci minuti. Monitorare la morfologia cellulare al microscopio.
Quando la maggior parte delle cellule diventa rotonda, aggiungere lo stesso volume di mezzo freddo per pozzo, pipettare delicatamente le celle per staccarsi dalla piastra e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo da 15 millilitri. Questo passaggio è fondamentale per l'affidabilità degli epatociti. Se le cellule sono difficili da staccare dalla piastra, alcune possono essere lasciate sul piatto.
E se le cellule si staccano, quindi pipettare delicatamente dopo la centrifugazione, per ottenere una sospensione a cella singola. Ripetere la procedura di distacco cellulare per ogni pozzo fino a quando non vengono raccolte quasi tutte le cellule attaccate. Quindi centrifugare a 200 g per tre minuti a quattro gradi celsius.
Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo le cellule con due millilitri di PBS freddo nel tubo dei quindici millilitri. Pipettare delicatamente le celle per ottenere una sospensione a cella singola. Quindi, passare le cellule attraverso un colino cellulare da 40 micron per rimuovere gli aggregati.
Normalmente, da uno a due milioni di cellule circa possono essere raccolte dopo pochi ter-ing. Aggiungere quindi microlitri dello 0,4% di soluzione blu Trypan a 20 microlitri di sospensione cellulare. Contare le celle e registrare la concentrazione della sospensione cellulare come C.Calcolare il volume richiesto di sospensione cellulare per iniettare un milione di celle per topo.
Quindi allocare il volume richiesto di sospensione cellulare in tubi da 15 millilitri e centrifugare a 200 g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il supernatante, sospendere di nuovo le celle in 27,5 microlitri di PBS freddo per mouse. E poi aggiungere un volume uguale di matrice extracellulare per un volume finale di 55 microlitri per mouse.
Ora, metti una delle siringhe per insulina fredda sul ghiaccio. Scollegare il pistone, trasferire 55 microlitri di sospensione cellulare nella siringa e quindi rimettere il pistone indietro. Scaricare le bolle con attenzione e rimettere la siringa sul ghiaccio.
Assicurarsi che i topi LRG siano adeguatamente anestetizzati prima di iniziare la procedura di iniezione. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante la procedura di anestesia. Una volta che il topo ha perso il riflesso muscolare alla stimolazione, posizionarlo nella posizione destra, laterale e decubito.
Applicare uno spesso strato di crema depilatoria sull'area di incisione nel fianco sinistro e lasciare per cinque o otto minuti. Rimuovere la crema depilatoria e i capelli pulendo l'area con un cuscinetto di garza inumidito dall'acqua. Strofinare il fianco sinistro con il 70% di etanolo tre volte.
Quindi individuare la milza, che può essere vista nel fianco sinistro. Seguito da un'immersione finale con betadina per la disinfezione. Dopo aver usato le forbici per fare un'incisione da 0,5 a un centimetro nella pelle e nella parete addominale, utilizzare le forcelle per esternalizzare la milza tirando delicatamente il tessuto adiposo circostante.
Stabilizzare delicatamente la milza usando un tampone. Inserire l'ago della siringa per insulina da tre a quattro millimetri nel parenchima della milza e iniettare delicatamente circa 50 microlitri di sospensione cellulare. Ritrarre l'ago e posizionare un batuffolo di cotone sopra l'iniezione per un minuto per evitare sanguinamenti e fuoriuscite di materiale.
Riportare la milza al peritoneo e chiudere la ferita con suture di nylon a cinque ore. Dopo aver suturato, posizionare il mouse in una gabbia pulita con facile accesso a cibo e acqua. Inizia rimuovendo gli organi interni dal topo appena eutanasiato in modo che l'aorta discendente, parallela alla colonna vertebrale, sia visibile.
Quindi sezionare il tessuto adiacente e rimuovere il cuore. Utilizzare forbici fini per sezionare le aortae, mettendole in soluzione Krebs fredda e ossigenata. Dopo la raccolta, trasferire l'aortae in soluzione Krebs in una piastra di Petri rivestita in silicone.
Fissare il tessuto connettivo per fissare la posizione dell'aorta senza allungarla. Al microscopio sterile, utilizzare forcelle fini e forbici a molla per sezionare l'aorta libera dal grasso circostante e dal tessuto accidentale senza danneggiare la parete del vaso. Quindi tagliare ogni aorta in un segmento di lunghezza da un millimetro e mezzo a due millimetri.
Quindi, tagliare un pezzo lungo due centimetri di filo inossidabile spesso 40 micron e inserire delicatamente nell'aorta lumen. Tenere il filo per trasferire il segmento nella camera del miografo del filo, riempita con soluzione krebs ossigenata. Per misurare la lunghezza dei segmenti aortae quando si studia la contrattilità, posizionare ogni segmento perpendicolarmente tra le ganasce e registrare la lettura D1 sul micrometro.
Quindi rimuovere il segmento e spostare le mascelle insieme. Registrare la lettura D0 e calcolare la lunghezza del segmento. Quindi, bloccare il filo e fissarlo con il cacciavite mentre si posiziona il segmento non teso tra le ganasce.
Per la normalizzazione prima dell'esperimento, impostate il miografo su zero nella posizione non tesa. Quindi spostare lentamente le mascelle a parte e osservare il cambiamento della tensione dell'aorta fino a raggiungere tre millinewton. Dopo 15 minuti, scolare la soluzione dalla camera del miografo e sostituirla con una fresca soluzione Krebs.
Dopo aver aspettato altri 15 minuti, regolare nuovamente la tensione a tre millinewton. Quindi cambiare la soluzione Krebs standard in soluzione Krebs integrata con cloruro di potassio da 60 millimolare, per indurre la contrazione per almeno quindici minuti. Risciacquare con soluzione di Krebs fresca tre volte, quindi aggiungere concentrazioni crescenti di fenilefrina.
Ad esempio, da 10 nanomolari a 100 micromolari. Quindi, dopo aver lavato con la soluzione di Krebs standard, aggiungere una singola concentrazione di fenilefrina, a circa il 70% della contrazione massima. Quando la contrazione è stabile, aggiungere concentrazioni crescenti di acetilcolina a intervalli di due minuti.
Per esempio, da uno a tre nanomolari a dieci-trenta micromolari per indurre la vasodilatazione. Questa immagine mostra un'immagine rappresentativa scansionata a sezione intera della colorazione dell'albumina umana in un fegato di topo ripopolato con iHeps carenti di lipoproteina a bassa densità. Le frecce indicano gruppi di iHeps umani innestati nel fegato del topo.
I gruppi di iHeps umani innestati sono visti più in dettaglio qui. Questo grafico scatterplot mostra la percentuale di cellule positive di albumina umana ripopolate corrispondenti a iHep contenenti aree nel fegato di topo, da diversi iPSC donatori. Questa è un'immagine rappresentativa della colorazione immunoistochimica per i nuclei umani in un fegato di topo, con ipercolesterolemia familiare inchiostrata iHeps.
Il grafico a barre mostra la percentuale di iHeps positivi dei nuclei umani ripopolati provenienti da diversi iPSC donatori nei fegati di topo LRG. Si tratta di immagini rappresentative dell'albumina umana e dei nuclei umani che si macchiano su due sezioni consecutive di un fegato di topo, ripopolate con iHeps di tipo selvaggio. Infine, questa immagine mostra vasodilatazione dipendente dall'endotelio dell'aorta nei topi chimerici epatici umani ipercolesterolemia familiare, in risposta alle crescenti concentrazioni di acetilcolina.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare topi chimerici epatici umani, usando epatociti derivati dall'iPSC umano.
