Il nostro protocollo descrive un semplice sistema in vitro, per studiare l'effetto di molecole isolate sulla morfologia e sulla struttura del carbonato di calcio. Questa tecnica è vantaggiosa nei casi in cui le biomolecole che test sono costose, o disponibili in piccole quantità, così come quando è richiesta una lenta precipitazione del carbonato di calcio. Inoltre, consente di sondare più esperimenti di precipitazione nelle stesse condizioni contemporaneamente.
In primo luogo, preparare l'esperimento di controllo. Utilizzare acqua tripla distillata ed etanolo per pulire pezzi di vetro e vetreria. Usa una penna diamanta per tagliare pezzi di uno scivolo al microscopio di vetro, in modo che si adattino a un pozzo di una piastra da 96 pozzetti.
Posizionare i posti di vetro in un becher con acqua distillata tripla, in modo che l'acqua copra gli scivoli di vetro. Sonicare in un sonicatore da bagno per 10 minuti. Decantare l'acqua.
Aggiungere l'etanolo per coprire le diapositive di vetro e sonicare di nuovo in un sonicatore da bagno per 10 minuti. Quindi, asciugare le diapositive e le vetrerie con un flusso di gas azoto e posizionarle in un detergente per il plasma d'aria per 10 minuti a 130 watt. In una cappa aspirante, riempire i pozzi agli angoli di una piastra da 96 po 'con polvere di carbonato di ammonio e sigillare la piastra usando un foglio di alluminio.
Coprire il foglio con pellicola di paraffina. Pulire qualsiasi carbonato residuo di ammonio utilizzando gas azoto. Posizionare i pezzi di vetro precedentemente tagliati e puliti in cinque diversi pozzi più vicini al centro.
Riempire ogni pozzo recante un pezzo di vetro con 100 microlitri di soluzione di cloruro di calcio preparato con acqua distillata tripla ad un gradiente crescente di 10, 20, 30, 40 e 50 concentrazioni millimolari. Successivamente, forare la copertura di ciascuno dei pozzali contenenti carbonato di ammonio tre volte con un ago. Rimettere il coperchio indietro, sigillare i bordi con pellicola di paraffina e tenerlo a 18 gradi Celsius in un'incubatrice per 20 ore.
Durante l'incubazione, il carbonato di ammonio viene decomposto in ammoniaca e anidride carbonica, che si diffondono in soluzioni di cloruro di calcio, con conseguente formazione di cristalli di carbonato di calcio. Dopo l'incubazione, aprire accuratamente il coperchio all'interno di una cappa dei fumi e utilizzare un anello per rimuovere i cristalli formatisi nell'interfaccia acqua-aria. Utilizzare una pinzetta per trasferire i pezzi di vetro in un becher contenente acqua distillata doppia per un breve tuffo.
Quindi, rimuovere i campioni dal becher e utilizzare il nastro a doppia mano per fissare i pezzi di vetro sul fondo della piastra di Petri. Asciugare l'acqua eccessiva toccando i bordi dello scivolo, con salviette tissutali. Coprire la piastra di Petri e posizionare in un essiccatore per 24 ore.
Osservare i cristalli formati sui pezzi di vetro con un microscopio ottico verticale a 10-40 volte l'ingrandimento. I cristalli rommboedri osservati sono molto probabilmente calcite. Se oltre ai cristalli romboedrici, la soluzione contiene cristalli sferici che sono molto probabilmente vaterite, ripetere il protocollo di cristallizzazione, assicurandosi che la fase di pulizia sia eseguita correttamente.
Inoltre, assicurarsi che non vi sia carbonato di ammonio in aree della piastra diverse dai pozzi dedicati. La concentrazione ottimale per il cloruro di calcio è determinata in base al campione ricco di cristalli di calcite sfaccettati lisci senza cristalli di vaterite. Per iniziare, pulire vetrini e vetrerie come fatto in precedenza.
In una cappa aspirante, posizionare la polvere di carbonato di ammonio negli angoli di una piastra da 96 po '. In ogni pozzo in cui si verificheranno precipitazioni, posizionare un pezzo di vetro che è stato tagliato e pulito. Preparare i pozzi di controllo.
In due pozzi di controllo, pipetta 90 microlitri di 25 millimolare Tris buffer a pH 8, integrati con cloruro di sodio 100 millimolare. Quindi aggiungere 10 microlitri di soluzione di 0,5 molare di cloruro di calcio. Quindi, regolare la concentrazione di proteina additiva TapA a 10 tapa micromolare, cloruro di sodio millimolare 100 millimolare e tampone Tris millimolare a pH 8.
Preparare l'additivo contenente pozzi aggiungendo 90 microlitri della soluzione additiva. Aggiungere 10 microlitri di soluzione di cloruro di calcio molare all'additivo contenente pozzi per raggiungere la concentrazione ottimale a 50 millimolare di cloruro di calcio determinato in precedenza. Preparare la piastra con fori sul coperchio su pozzi contenenti carbonato di ammonio e incubare a 18 gradi Celsius come fatto in precedenza.
Dopo l'incubazione, preparare i pezzi di vetro in una piastra di Petri come fatto prima e mettere il piatto in un essiccatore per 24 ore. Per quantificare la percentuale di massa degli additivi nel carbonato di calcio precipita, verificare innanzitutto il coefficiente di estinzione dell'additivo utilizzato. Quindi, utilizzare un microbilanciamento per pesare i pezzi di vetro in cui si sono formati i cristalli.
Successivamente, raschiare i cristalli dal vetro in un tubo eppe con 1,2 millilitri di soluzione di acido acetico molare 0,1. Vortice brevemente, quindi posizionare il tubo in un sonicatore per sonicare il campione fino a quando i cristalli scompaiono. Conservare il campione a temperatura ambiente per 24 ore.
Pesare lo scivolo di vetro dopo aver raschiato i cristalli. Misurare l'assorbanza UV A della soluzione sonicata da 1,2 millilitri a 280 nanometri per l'additivo proteico. Usa l'equazione di Beer-Lambert per calcolarne la concentrazione c.
L è il percorso ottico all'interno della cuvetta. Per calcolare la massa degli additivi nel cristallo, utilizzare l'equazione, c per v è uguale a m, se la concentrazione è in milligrammi per millilitro. Se la concentrazione è in talpe per litro, calcolare le talpe applicando c per v uguale a n.
Quindi utilizzare il peso molecolare per calcolare la massa degli additivi. Calcolare la percentuale di peso degli additivi nei cristalli. M è la massa degli additivi, e delta m s, è la massa dei cristalli di carbonato di calcio che sono stati raschiati dal pezzo di vetro.
Le immagini SEM mostrano il confronto tra un controllo corretto con facce di calcite lisce e cristalli di calcite con facce composte da gradini. I cristalli sferici sono vaterite. Gli esperimenti di controllo riusciti e non riusciti portarono alla spettroscopia Raman, mostrando rispettivamente gli spettri tipici della calcite e della vaterite.
La divisione dello spostamento raman a circa 1080 per centimetro è la caratteristica più evidente della vaterite. I cristalli di carbonato di calcio formatisi in presenza di TapA, sono distinti dai cristalli di controllo. Si formò un complesso assemblaggio sferico di carbonato di calcio, composto da più microcristalli di calcite.
Lo spettro Raman dei cristalli formatisi in presenza di TapA, è simile allo spettro della calcite. Gli spettro assorbenti del TapA, e il controllo senza l'additivo, sono stati misurati in seguito alla dissoluzione dei cristalli nell'acido. La percentuale di massa di TapA è stata determinata in 1,8 più o meno 0,2%È fondamentale seguire attentamente le fasi di pulizia e assicurarsi che gli standard di controllo siano soddisfatti prima di testare l'effetto degli additivi sulla formazione di carbonato di calcio.
Inoltre, è importante rimuovere qualsiasi eccesso di carbonato di ammonio in polvere dai pozzi. Il carbonato di ammonio si decompone in ammoniaca e anidride carbonica. L'ammoniaca è tossica se inalato e, pertanto, il carbonato di ammonio deve essere maneggiato solo all'interno di una cappa aspirante.
Per valutare la morfologia interna e la struttura dei cristalli, è possibile sescolarli utilizzando un fascio ionico focalizzato, immaginare le sezioni con un microscopio elettronico a trasmissione e misurare i modelli della diffrazione elettronica da posizioni specifiche lungo le sezioni. Questa tecnica è stata precedentemente utilizzata per studiare l'effetto di varie molecole sulla morfologia e sulla struttura del carbonato di calcio. Abbiamo elaborato questo metodo ai biopolimeri prodotti da cellule batteriche nei biofilm.
Sarà interessante eseguire ulteriori studi con altri biopolimeri prodotti da diversi ceppi batterici.
