Questo metodo combina la capacità di macchiare una proteina di membrana preservando al contempo l'integrità della membrana e l'architettura subcellulare. Quindi è molto potente per localizzare con precisione una proteina associata alla membrana. Il principale vantaggio di questa tecnica è che combina l'uso di una robusta etichetta geneticamente clonabile, APEX2, con metodi all'avanguardia nella conservazione cellulare per la microscopia elettronica, inclusa la criofissazione e la sostituzione del congelamento.
Insieme, questi consentono una localizzazione precisa delle proteine all'interno di una cellula ben conservata. Questo protocollo può essere utilizzato per sezionare meccanismi mediante i quali i virus si replicano all'interno della cella host. I virus spesso dirottano le proteine ospiti durante il loro schema di infezione.
I virus sono i piccoli genomi, che usano per replicarsi all'interno di queste cellule ospiti. Recentemente, siamo stati in grado di etichettare queste proteine in dati inediti usando questa tecnologia per capire come i virus si replicano. Questa tecnica si è rivelata davvero critica in un recente studio collaborativo su una tossina batterica che causa la rottura del golgi.
Utilizzando cryoAPEX, siamo stati in grado di localizzare con precisione la tossina con i pezzi di golgi frammentati, qualcosa che era davvero difficile da vedere altrimenti usando le normali tecniche di immunofluorescenza. A dimostrare questa tecnica sarà Elaine Mihelc, una studentessa laureata e ricercata, Stephanie Angel, dei nostri laboratori. Dopo aver seminato cellule HEK293 nel piatto, trasfezionare le cellule con plasmidi di espressione di mammiferi taggati APEX2 utilizzando il reagente di trasfezione secondo le indicazioni del produttore.
A 12-15 ore dopo la trasfezione, lavare le cellule una volta con PBS. Quindi, lavare le cellule con PBS dal piatto in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifuga a 500 x g per cinque minuti.
Rimuovere con cura il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in due millilitri di glutaraldeide al 2% e tampone di cacodilato di sodio molare 0,1 a pH 7,4 a temperatura ambiente. Posizionare il campione sul ghiaccio per incubare per 30 minuti. Quindi, pellet il campione a 500 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Lavare il pellet tre volte per cinque minuti ciascuno con due millilitri di tampone di cacodilato di sodio molare di 0,1 centrifugando a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante. Per effettuare la reazione di perossidasi, lavare il pellet sospendendo in tre millilitri di soluzione DAB seguita da pellettizzazione a 500 x g per cinque minuti.
Quindi, sospendere di nuovo il pellet in tre millilitri di soluzione DAB con perossido di idrogeno millimolare da 5,88 millimolare. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Il pellet diventa visibilmente di colore marrone, indicando la presenza del prodotto di reazione DAB insolubile.
Dopo aver lavato nuovamente con tampone di cacodilato di sodio in DMEM, secondo il manoscritto, sospendere nuovamente il pellet cellulare in 500 microlitri di una soluzione crioprotettiva di DMEM contenente il 10% di siero bovino fetale e il 15% di albumina di siero bovino. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 0,5 millilitri. Pellet di nuovo, aumentando leggermente la velocità di centrifuga da 500 x g.
Scartare la maggior parte del supernatante, assicurando che sia lasciato abbastanza liquido in modo che il pellet non si asciughi. Allontanare il liquido rimanente dal pellet di cella utilizzando l'angolo di una salvietta da laboratorio o di un tovagliolo di carta. Lasciare che rimanga abbastanza liquido che il pellet forma una pasta, simile in consistenza al dentifricio.
Aspirare da due a tre microlitri del pellet cellulare e depositarlo su un supporto a membrana. Riempire completamente il pozzo del supporto della membrana in modo che la tensione superficiale crei una leggera cupola sulla parte superiore. Far scorrere il supporto della membrana nella cartuccia e fissare.
Posizionare la cartuccia nella macchina HPF che è stata predisposta e innescata e premere start to freeze. Mantenendo le cartucce immerse nell'azoto liquido, rimuovere il supporto della membrana dalla cartuccia. Mettere in una capsula di plastica e posizionare la capsula di plastica in un Cryovial pieno di azoto liquido.
In una cappa chimica, preparare un millilitro per campione della soluzione dello 0,2% di peso in volume di acido tannico e del 5% di acqua DI in acetone in un Cryovial. Metterli in azoto liquido per congelarli. Posizionare la miscela di sostituzione del congelamento di una fiale e i cryoviali contenenti i pellet di cellule congelate nella camera di campionamento delle unità di sostituzione del congelamento.
Trasferire la capsula interna contenente il portatore di membrana dalla fiala di azoto liquido nel flaconcino corrispondente contenente la miscela di sostituzione del congelamento. Avviare un protocollo di sostituzione del blocco a 90 gradi Celsius. Dopo 24 ore, mettere in pausa la sostituzione del congelamento e lavare i campioni tre volte per cinque minuti con acetone che è stato raffreddato a 90 gradi Celsius.
Successivamente, in una cappa chimica, preparare un millilitro per campione di una soluzione di 1%di tetrossido di osmio, 0,2% di acetato di uro e 5%DI di acqua in acetone in un cryovial e metterli in azoto liquido per congelarli. Posizionare i Cryovials con la miscela di sostituzione del congelamento due nell'unità di sostituzione del congelamento e trasferire le capsule dal terzo lavaggio di acetone nella miscela di sostituzione del congelamento due fiale. Incubarli e congelare la combinazione di sostituzione due per 72 ore a 90 gradi Celsius, seguita da un riscaldamento graduale a zero gradi Celsius per 12-18 ore.
Mantenere la temperatura a zero gradi Celsius e aggiungere acetone pre-raffreddato nelle fiale per lavare tre volte per 10 minuti ciascuno. Preparare una miscela di resina preferita in un bicchiere di plastica secondo le indicazioni del produttore e aggiungere il 2%4% e l'8% di resina nelle fiale per immergere le capsule. Incubare per due ore ciascuno a zero gradi Celsius.
Quindi, incubare in 15%30%60%90% e 100% componenti in resina di A, B e D solo per quattro ore ciascuno a temperatura ambiente. Dopo le 20 ore, preparare una miscela di componenti in resina A, B, C e D e incubare per quattro ore. Posizionare i portatori di membrana con il lato del pellet cellulare in stampi di incorporamento piatti e riempire con la miscela di resina A, B, C e D.Metterli in un forno per polimerizzare a 60 gradi Celsius per 24-36 ore.
Dopo la polimerizzazione, rimuovere i blocchi dallo stampo e posizionare il campione nel mandrino verticale dell'ultra microtomo dove può essere visualizzato con ingrandimento. Separare il supporto della membrana dal blocco da una combinazione di azoto liquido tamponato sul supporto della membrana per separare il metallo dalla plastica e utilizzare una lama di rasoio per scheggiare la resina intorno al supporto della membrana. Una volta separato, sollevare delicatamente il supporto della membrana, lasciando la cupola del pellet cellulare sulla faccia del blocco.
Posizionare il blocco con il pellet di cellule esposte rivolto verso l'alto in uno stampo di incorporamento piatto leggermente più profondo del primo stampo e riempire con componenti in resina A, B, C e D.Polimerizzare a 60 gradi Celsius per 24-36 ore. Tagliare il blocco intorno al pellet di cella utilizzando una lama di rasoio. Quindi posizionare il blocco nel mandrino del campione sul braccio di sessatura di un ultra microtomo.
Utilizzando un coltello di vetro o diamanto, tagliare il blocco in una forma trapezoidale che circonda strettamente il pellet cellulare. Ottenere sezioni ultra sottili di 90 nanometri del pellet cellulare utilizzando un coltello di vetro o diamante. Raccogliere una barra multifunzione di sezioni su una griglia TEM.
Asciugare la griglia gonfiando il bordo su un pezzo di carta da filtro e conservarlo in una scatola di stoccaggio della griglia TEM. Montare la griglia sul supporto TEM e posizionare il supporto al microscopio. Utilizzare un Tecnai T12 a 80 kilovolt per lo screening di campioni crioAPEX.
Acquisire immagini di cellule e strutture subcellulari di interesse con l'etichettatura APEX2. In questo studio, la preparazione del campione con i metodi tradizionali APEX ha portato a una chiara etichettatura di strutture endoplasmatiche organizzate e lisce del reticolo. Ad alto ingrandimento, le membrane impilate apparivano arruffate e erano presenti spazi non uniformi tra densità concentriche della membrana, indicando una scarsa conservazione della membrana e l'estrazione lipidica.
Il campione preparato dal crioAPEX aveva anche un'etichettatura chiaramente definita di strutture del reticolo endoplasmatiche organizzate e lisce, tuttavia, le membrane erano lisce e parallele e si vedeva poca o nessuna estrazione lipidica. L'analisi TEM di sezioni sottili di 90 nanometri ha rivelato che la proteina interagente del lievito Huntington E era presente in tutto il reticolo endoplasmatico periferico e nell'involucro nucleare. Inoltre, la proteina E interagente del lievito Huntington è stata risolta in focolai regolarmente distanziati lungo la membrana del reticolo endoplasmatico luminale.
La distribuzione e i fuochi della proteina E interagente del lievito Huntington erano visibili anche in un campione preparato con fissazione e disidratazione tradizionali. Tuttavia, erano presenti estese interruzioni ed estrazioni della membrana, rendendo il campione non ottimale. L'etichettatura APEX2 è stata eseguita utilizzando tre marcatori cellulari, di cui mito-V5-APEX2 ha fornito una colorazione specifica solo dei mitocondri e CAAX-APEX2 ha prodotto una colorazione distinta solo della membrana plasmatica.
Non è stata osservata alcuna etichettatura negli organelli intracellulari. La colorazione per il golgi lume è stata valutata anche utilizzando un marcatore Alpha MAN2-APEX2 come descritto nel nostro manoscritto originale Sengupta et al. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti metodi tridimensionali come la tomografia elettronica o la microscopia elettronica a scansione di fascio ionico focalizzato al fine di indagare la distribuzione 3D di una proteina di interesse.
Molte delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossiche, quindi prima dell'uso, le schede di dati di sicurezza dovrebbero essere consultate per garantire che le sostanze chimiche siano maneggiate utilizzando adeguati dispositivi di protezione individuale e smaltite secondo le linee guida istituzionali.
