Questo protocollo fornisce una tecnica per aumentare l'efficienza del caricamento della piastra di estrazione del DNA a 96 pozzi riducendo allo stesso tempo il rischio di contaminazione incrociata del campione. Questa tecnica riduce le possibilità di contaminazione durante la prima fase critica dell'estrazione del DNA attraverso l'aggiunta individuale di campioni ad ogni pozzo nella piastra da 96 pozzi. Questa metodologia può essere applicata a uno dei diversi campi della ricerca sul microbioma.
Prima di iniziare un esperimento, nebuli la panca con il 70% di etanolo. Dopo la pulizia, lasciare asciugare la panchina all'aria prima di spruzzare la panca con il 10% di candeggina. Dopo la pulizia e l'asciugatura ad aria, immergere le forbici chirurgiche microscopulari, spatolari e curve nel 95% di etanolo ed esporre gli strumenti a una fiamma.
Quindi immergere ogni utensile in candeggina al 10% e lasciare asciugare all'aria gli utensili. Prima del sotto-campionamento, l'etanolo sterilizza i guanti e omogeneizza accuratamente i campioni di terreno. Assegnare quindi un ID campione con posizione del pozzo a ciascun tubo.
Riempire 95 tubi di centrifuga a due millilitri con un campione per tubo, fino a quando ogni tubo è circa mezzo pieno. Il 96° tubo deve essere utilizzato come vuoto di estrazione. Posizionare i tubi del sottocampo sul ghiaccio ed etichettare 96 tubi PCR sterili a cappuccio piatto da 200 microliter in base alle etichette dei pozzi per una piastra da 96 pozzetti, quindi posizionare l'etichetta 200 tubi microliter in ordine in un rack da 96 pozzetti.
Per preparare una piastra da 96 po 'per l'esperimento, rimuovere il coperchio dalla piastra e posizionare il coperchio in un sacchetto di plastica sterile. Sigillare il sacchetto per evitare contaminazioni e coprire la piastra con un pezzo pretaglio di pellicola di tenuta perforabile. Quindi utilizzare un rullo di gomma per aderire saldamente alla guarnizione della piastra e conservare la piastra a quattro gradi Celsius.
Per trasferire i sottocampi alla piastra, posizionare 24 dei due tubi del sottocampo millilitro in un blocco di ghiaccio per lo stoccaggio a freddo e utilizzare il nome del campione e la scheda di localizzazione del pozzo per selezionare i tubi a chiusura piatta da 200 microlitri appropriati. Vortice i sottocampi uno alla volta, per cinque secondi per campione per garantire l'omogeneizzazione e caricare circa 200 microlitri di ciascun campione nell'appropriato tubo PCR corrispondente. Una volta caricati tutti i 24 campioni, utilizzare una salvietta di carta imbevuta sbiancata per pulire l'esterno di un tubo PCR e invertire e toccare il tubo sulla panca per spostare il campione nella parte superiore del tubo.
Utilizzando la fiamma le forbici sterilizzate e sbiancate agganciano il fondo del tubo PCR per creare un'apertura per il campione e passano il tubo sopra la piastra con l'estremità tagliata rivolta verso l'alto fino a raggiungere il pozzo appropriato. Inclinare leggermente la piastra, per facilitare la foratura della pellicola di tenuta foraggibile pretagliata e con il tubo direttamente sopra il pozzo corretto, invertire rapidamente ma con attenzione la piastra in modo che la punta tagliata si adatti al pozzo. Utilizzare uno strumento sterilizzato per toccare la parte superiore del tubo fino a quando tutto il terreno non è caduto dal tubo nel pozzo.
E lasciare il tubo nel pozzo con il piombo chiuso. Quando tutti i campioni sono stati caricati nello stesso modo, rimuovere un tubo PCR a punta piatta da 200 microlitri e aggiungere 750 microlitri di soluzione di perline al pozzo del campione. Riposizionare il tubo PCR a punta piatta da 200 microliter nel pozzo spingendolo fino in fondo al pozzo.
E usa uno Sharpie per contrassegnare la parte superiore del tubo per indicare che il pozzo è stato caricato. Quando tutti i pozzi sono stati caricati con perline, riportare i 24 tubi campione a 20 gradi Celsius e aggiungere 24 nuovi tubi sottocampo al blocco di ghiaccio, per consentire il caricamento del prossimo set di campioni nella piastra da 96 po 'come appena dimostrato. Quando tutti i 95 dei pozzi sono stati caricati con soluzione di campioni e perline, aggiungere la soluzione di perline solo al 96 ° pozzo.
Rimuovere tutti i tubi, passandoli solo sui pozzi coperti e rimuovere con cura la pellicola perforabile dalla piastra. Quindi trasferire con cura il coperchio della piastra dal sacchetto di plastica alla piastra e posizionare la piastra a 20 gradi Celsius fino all'estrazione pianificata. Un confronto dei metodi di caricamento delle lastre mostra che il metodo dimostrato si traduce nella più bassa concentrazione di DNA all'interno dei pozzi vuoti.
Usando questo metodo, la concentrazione di DNA era significativamente più bassa quando si utilizzava il metodo proposto da McPherson et al. Sebbene la concentrazione di DNA con questo metodo non fosse statisticamente diversa dal metodo predefinito del qiagen. Tutti e tre i metodi producono concentrazioni medie di DNA sotto due nanogrammi per microlitro.
Sebbene solo questo nuovo metodo produca pozzi senza concentrazione misurabile di DNA. Per ridurre al minimo il potenziale di fuoriuscita, mantenere il tubo di 200 microliter in posizione verticale quando lo si sposta sulla piastra, inclinare la piastra e inserire il tubo nel pozzo corretto.
