Il protocollo qui dimostrato può contribuire a chiarire la biosintesi dei polifosfati inositoli delle piante e a rispondere alle domande relative al loro ruolo in alcuni aspetti del metabolismo e dello sviluppo delle piante. Questo metodo è molto sensibile perché l'uso del precursore radioattivamente etichettato dei fosfati di inositolo consente di rilevare in modo affidabile tutte le specie di fosfato di inositolo nelle piante. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché la maggior parte dei biologi vegetali non ha familiarità con l'analisi HPLC e la configurazione necessaria.
Inoltre, le fasi critiche di questo protocollo, come l'estrazione di fosfati di inositolo, sono difficili da seguire senza un'adeguata dimostrazione. Iniziare impostando un sistema composto da due pompe HPLC indipendenti, una per il buffer A e una per il buffer B. Entrambe le pompe devono essere controllate insieme tramite un computer o una pompa master. Implementare un lavaggio della guarnizione del pistone per entrambe le pompe, tramite forza gravitazionale o attraverso una terza pompa a bassa pressione.
Collegare entrambe le pompe a un mixer dinamico, quindi collegare il miscelatore a una valvola di iniezione con un loop campione con una capacità di almeno un millilitro. Utilizzare i capillari per collegare la valvola di iniezione alla colonna e la colonna al raccoglitore di frazioni. Semina semi di loto in una fila su piatti petri quadrati pieni di solidi mezzi di crescita costituiti da agar batteriologico dello 0,8% in acqua deionizzata.
Lasciare che i semi stratifichino per almeno tre giorni a quattro gradi Celsius al buio. Posizionare i semi in un incubatore di crescita. Trasferire da 10 a 20 piantine in un pozzo di una piastra di coltura cellulare piatta a 12 ben chiara riempita con due millilitri di soluzione di sale MS a mezza resistenza che viene integrata con l'1% di saccarosio e regolata in pH 5,7.
Aggiungere 45 microcurie di mio-inositolo 3H alla piastra e ruotarla delicatamente. Coprire la piastra con un coperchio e sigillarla con nastro chirurgico microporous. Quindi riposizionare di nuovo nell'incubatore di crescita.
Dopo cinque giorni di etichettatura, rimuovere le piantine dal supporto e lavarle brevemente con acqua deionizzata. Asciugarli con tovaglioli di carta e trasferirli in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri, assicurandosi di non riempire troppo il tubo. Agganciare congelare il tubo in azoto liquido e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione.
Prelevare i campioni dal congelatore e conservarli in azoto liquido fino a quando non sono pronti per l'uso. Macinarli con un pestello del tubo di microcentrifugo fino a quando non iniziano a scongelarsi, quindi aggiungere 500 microlitri di tampone di estrazione del freddo ghiacciato. Continuare la rettifica fino a quando il campione non è omogeneizzato e la soluzione è colorata.
Centrifugare i campioni per 10 minuti a 18.000 volte G e quattro gradi Celsius. Quindi trasferire il supernatante in un tubo fresco da 1,5 millilitri. I tubi utilizzati per l'estrazione sono considerati residui radioattivi solidi e devono essere smaltiti di conseguenza.
Aggiungere con cura 300 microlitri di tampone di neutralizzazione all'estratto, che causerà immediatamente precipitazioni di proteine e gorgogliamento. Dopo un minuto, mescolare il campione con una punta di pipetta e pipettare cinque microlitri su carta pH per assicurarsi che il pH sia compreso tra sette e otto. Se necessario, aggiungere piccole quantità di tampone di neutralizzazione o tampone di estrazione fino al raggiungere il pH desiderato e lasciare riposare i campioni sul ghiaccio per almeno un'ora con un coperchio aperto.
Quindi centrifugarli per 10 minuti e trasferire il supernatante in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Dotare il raccoglitore di frazioni di 96 piccole fiale a scintillazione e riempire ogni fiala con due millilitri di un cocktail di scintillazione adatto compatibile con tamponi a basso pH e alte concentrazioni di fosfato di ammonio. Avviare il sistema HPLC, quindi attivare il lavaggio della guarnizione del pistone e mantenerlo attivato durante l'intera corsa.
Iniettare manualmente il campione con una siringa adatta. Avviare le pompe e la pendenza. Mentre l'esecuzione dell'HPLC è in corso, controllare regolarmente la pressione.
La pressione di partenza dovrebbe essere di circa 18-24 bar e dovrebbe lentamente salire a 50-60 bar una volta raggiunto il buffer B al 100%. Dopo la corsa, chiudere le fiale saldamente e vigorosamente scuotere le frazioni con il cocktail scintillante da mescolare. Se non si procede direttamente con la misurazione, tenere le fiale in posizione verticale al buio.
Per misurare le frazioni, inserire le fiale nei rack del contatore di scintillazione utilizzando rack che si adattano alle piccole fiale e misurare ogni flaconcino per cinque minuti in un contatore di scintillazione liquido. Preparare un grafico a linee 2D in cui i conteggi misurati al minuto o cpm vengono tracciati rispetto al tempo di conservazione. Per confrontare i campioni tra loro, normalizzare i dati sommando il CPM di ciascuna frazione diluita dal minuto 25 al 96 per ogni singolo campione e dividendo il CPM totale da tale campione per il CPM totale degli altri campioni.
Per eseguire quantificazioni relative di alcuni picchi di polifosfato inositolo e successivamente creare grafici a barre che contengono dati di repliche per analisi statistiche, continuare l'analisi con un software specializzato in grado di calcolare le aree di picco dei cromatogrammi. Qui viene mostrato uno spettro completo di polifosfato inositolo ottenuto dagli estratti di A.thaliana dopo il conteggio delle scintillazioni. Le cime sono ben separate e possono essere assegnate a diversi isomeri.
Quando si utilizza una colonna invecchiata, è visibile una chiara riduzione dell'exakisfosfato di inositolo e l'assenza di pirofosfato inositolo. L'analisi SAX-HPLC è stata eseguita anche su piantine L.japonica che sono state coltivate ed etichettate nelle stesse condizioni delle piantine arabidopsis. Mentre presumibilmente si possono vedere tutte le specie di polifosfato inositolo e i picchi noti dall'Arabidopsis, ci sono differenze nelle quantità relative di specifici isomeri polifosfati inositolo tra le due specie.
Per dimostrare che i campioni non devono essere analizzati immediatamente dopo l'estrazione, un campione è stato diviso in due e metà di esso è stato analizzato il giorno successivo dopo la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Le differenze tra i profili SAX-HPLC dei campioni freschi e congelati non erano significative, dimostrando che un ciclo di congelamento-disgelo non danneggia il campione e che il metodo stesso genera risultati riproducibili. Quando si tenta questo protocollo, macinare sempre accuratamente i campioni, congelati e con tampone di estrazione, e puntare a un pH vicino al neutro dopo la neutralizzazione per garantire il massimo recupero del fosfato di inositolo radio-etichettato per l'analisi SAX-HPLC.
È possibile purificare le radioetichetti da una corsa SAX-HPLC per un uso successivo, ad esempio nelle reazioni reciproche raccogliendo frazioni senza cocktail a scintillazione e misurando solo piccole aliquote.
