Questo metodo identifica microrganismi congiuntivali oculari vitali, il che è impegnativo a causa dell'ambiente ostile degli occhi. Può aiutare a rispondere se esiste un microbioma oculare e come la presenza batterica cambia nella malattia degli occhi. A differenza del sequenziamento del DNA, che identifica microrganismi sia vivi che non vivi, questo metodo identifica solo microrganismi vivi, risultando in una comprensione più chiara della comunità commensal oculare.
Gli studi suggeriscono che le malattie oculari difficili da diagnosticare come l'occhio secco non autoimmune e autoimmune hanno una presenza batterica oculare unica. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per diagnosticare le malattie degli occhi con firme microbiche distintive. Inizia con l'autoclave della quantità appropriata di batting di cotone e stuzzicadenti per il numero di topi da tamponare, quindi pizzica un pezzo di cotone lungo 1/2 centimetro e stuzzicandolo tirando fuori i bordi per formare un singolo strato poroso piatto che si ferma poco prima che la battuta cada a pezzi.
Ruotare la battuta intorno a una delle estremità affilate dello stuzzicadenti tenendo leggermente il pezzo teso sulla punta dello stuzzicadenti mentre è attorcigliato. Il tampone per gli occhi finito avrà uno strato molto sottile di cotone allungato sulla punta che si estende a circa 1/2 a un centimetro di distanza dalla punta. Inserire i tamponi in un piccolo becher, tamponare lateralmente verso il basso, quindi coprirli e autoclavarli.
Pulire l'area di lavoro con un disinfettante per ridurre al minimo la contaminazione e aliquota di 0,5 millilitri di infusione sterile di cuore cerebrale o mezzi BHI in tubi di micro centrifuga sterile da 1,5 millilitri etichettati. Fissare i tubi in un rack e mettere il rack sul ghiaccio. Impostare il flusso di lavoro da sinistra a destra a partire dalla stazione di anestetizzazione del mouse, che contiene la gabbia con i topi sperimentali, gabbia sterile vuota, anestesia a temperatura ambiente, ago calibro 25 e una siringa da un millilitro.
Successivamente, preparare una stazione di tamponamento oculare che contenga il BHI aliquoto su ghiaccio, tamponi sterilizzati, contagocce lubrificanti, contenitore a rischio biologico, asciugamani di carta puliti e spray isopropanolo al 70%. Infine, impostare la stazione di placcatura con piastre di agar del sangue a temperatura ambiente, una pipetta da 10 microliter, punte monouso sterili da 10 microliter e un contenitore di rifiuti a rischio biologico. Assicurarsi che il mouse sia anestetizzato correttamente spremendo un pedante posteriore.
Procedere solo se non c'è movimento. Assegnare una mano per gestire i topi anestetizzati e le altre mani per gestire il tampone oculare e la coltura. Rimuovere il mouse dalla gabbia e posizionarlo sopra la superficie di lavoro posizionata su un lato con l'occhio sinistro esposto.
Spruzzare le mani guantate con isopropanolo e asciugarle con un tovagliolo di carta. Scoltare il tubo di micro centrifuga BHI etichettato con la mano di movimentazione dei supporti dedicata e posizionare i due indietro nel rack. Immergere la punta rivestita di cotone del tampone per gli occhi nel BHI, quindi ritirare il tampone dal tubo mentre ruotare la punta due volte contro la camera d'aria per rimuovere il liquido in eccesso e rimuoverlo.
Con la mano di movimentazione del mouse, tenere delicatamente il mouse per la tracolla del collo. Con l'altra mano, posizionare la punta del tampone oculare contro la regione congiuntivale mediale dell'occhio sinistro. Deprimere leggermente il bulbo oculare e spostare il tampone in un movimento di lavaggio della finestra tra la palpebra inferiore e l'occhio 10 volte, mantenendo una pressione costante.
Senza toccare la pelliccia, rimuovere delicatamente la punta del tampone perpendicolare al punto in cui è stata inserita. Posizionare il lato in cotone tampone verso il basso, direttamente in un tubo di micro centrifuga etichettato con supporti BHI. Applicare un colliro sull'occhio tamponato.
Se lo si desidera, acquisire tamponi di pelle o pelliccia per campioni di controllo, sterilizzando i guanti in modo appropriato tra ogni tampone. Al termine, riportare il mouse nella gabbia. Lasciare riposare il tampone per 10-15 minuti sul ghiaccio, quindi sterilizzare le mani guantate e rimuovere il tampone mescolando la punta nel supporto per 10 rotazioni.
Ritirare il tampone ruotando la punta contro la parete interna del tubo per cinque rotazioni e smaltirlo in un contenitore a rischio biologico. Ripetere il processo per ogni mouse. Arricchire il campione incubando il tubo staticamente per un'ora a 37 gradi Celsius.
Durante l'incubazione, etichettare una piastra TSA a temperatura ambiente per tampone per occhio del mouse o tampone di controllo e dividerla a metà. Rimuovere i campioni arricchiti dall'incubatrice e metterli sul ghiaccio. Vortice brevemente i campioni da mescolare, quindi aliquota 10 microlitri del campione sulla piastra TSA e inclinare la piastra per formare una striscia.
Ripeti questo due volte. Dall'altro lato della linea di demarcazione delle piastre, creare 10 punti con 10 microlitri di campione ciascuno. Incubare i piatti a 37 gradi Celsius per 18 ore, due giorni e quattro giorni in una camera pulita che impedisce alle piastre di agar di asciugarsi.
Conta le colonie nelle strisce. Si noti morfologia e si calcolano le unità di formatura delle colonie per tampone per isolati morfologicamente simili. Guarda i punti in cui gli organismi unici non vengono catturati nelle strisce.
Per facilitare la visualizzazione, abbiamo placcato i batteri densamente nelle placche centrali e giuste. In genere, abbiamo osservato molto meno batteri nelle placche del tampone oculare. Si noti che a volte, i tamponi oculari potrebbero non produrre batteri recuperabili.
Qui viene mostrata una piastra rappresentativa per tamponi oculari con isolati morfologicamente diversi da un topo C57 nero a sei. Per ogni isolato distinto, le colonie furono contate nella striscia e l'abbondanza relativa fu calcolata e tracciata. Per la caratterizzazione microbiologica, i batteri sono stati prelevati da singole piastre per tamponi per topi per produrre una piastra TSA principale.
Quando è apparsa la crescita, sono stati eseguiti ulteriori test per caratterizzare o identificare i microbi. La piastra principale è stata utilizzata per fornire abbastanza inoculo per espandere i rispettivi isolati. Per identificare gli isolati, una piastra TSA è stata striata e incubata durante la notte e è stata eseguita la MALDI-TOF MS.
Esempi di isolati qui mostrati sono stati identificati come Streptococcus acidominimus e Aerococcus viridans. Livelli significativamente diversi di organismi commensali sono stati recuperati da maschi e femmine C57 neri sei topi. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans coagula stafilococchi negativi ed E.coli sono stati isolati dai topi C57 neri sei N.
Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che il miglior risultato sarà ottenuto rivestendo il tampone sottilmente e prendendo tempo durante la fase del tampone oculare. Se l'accesso alla MALDI-TOF MS è limitato, gli isolati possono essere identificati da test microbiologici e biochimici.
