Questa tecnica facilita la visualizzazione degli incontri di addotti del DNA marcati con antigene e può essere estesa alle interazioni di qualsiasi proteina con una struttura del DNA o una lesione suscettibile di immunorilevazione. Questo metodo può essere utilizzato per valutare le frequenze di interazione all'interno delle singole cellule, piuttosto che attraverso una popolazione, e consente la visualizzazione delle interazioni dipendenti dal ciclo cellulare in situ senza danneggiare le cellule. A dimostrare la procedura sarà Ishani Majumdar, un post-doc del Seidman Laboratory.
Il giorno prima dell'esperimento, seminare 1,5 volte 10 alla quinta cellula in due millilitri di mezzo su piatti di coltura con fondo di vetro da 35 millimetri pretrattati con soluzione adesiva cellulare. Il giorno successivo, sostituire il surnatante in ogni piatto con 37 gradi Celsius Cinque micromolari Dig TMP-integrato mezzo per le colture cellulari confluenti dal 50 al 70% e riportare le piastre all'incubatore di coltura cellulare per 30 minuti per consentire al Dig TMP di equilibrarsi. Mentre le cellule sono in incubazione, preriscaldare una scatola UV a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'equilibrazione, trasferire le piastre nella scatola preriscaldata per esporre le cellule a una dose di luce UVA di cinque minuti di tre joule per centimetro quadrato e sostituire i surnatanti con due millilitri di terreno di coltura fresco preriscaldato prima di restituire le piastre all'incubatore di coltura cellulare per un'ora. Alla fine dell'incubazione, lavare delicatamente le colture con PBS e fissare le cellule con un millilitro di formaldeide allo 0,1% in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule una volta con PBS prima di trattare le cellule due volte con 80 microlitri di tampone di estrazione del citoscheletro integrato con RNasi per cinque minuti a temperatura ambiente per trattamento per rimuovere il citoplasma.
Dopo la seconda incubazione, lavare le cellule con due millilitri di PBS tre volte prima di fissare le cellule con un millilitro di formaldeide al 4% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la seconda fissazione, lavare le cellule tre volte con PBS come dimostrato, seguito dal trattamento con un millilitro di metanolo freddo al 100% per 20 minuti a meno 20 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte in due millilitri di PBS, seguita da un'incubazione di 10 minuti in 80 microlitri di cinque millimolari Triton X-100 a quattro gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, trattare le cellule con 100 microlitri di cinque millimolari EDTA in PBS, integrati con un microlitro di 100 milligrammi per millilitro di RNasi A per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte in PBS prima di conservarle in albumina sierica bovina al 5% e siero d'asino al 10% in PBS in una camera umida durante la notte a quattro gradi Celsius. Per eseguire un test di legatura di prossimità, aggiungere 40 microlitri della soluzione anticorpale primaria di interesse al centro di ciascuna piastra e incubare le piastre nella camera umida per un'ora a 37 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte con due millilitri di PBST prima di aggiungere 40 microlitri di soluzione di sonda PLA appena preparata a ciascun piatto per un'ora di incubazione nell'incubatore di coltura cellulare. Al termine dell'incubazione, lavare le celle con tre lavaggi di 10 minuti in due millilitri di tampone A su una piattaforma inclinabile a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 40 microlitri di miscela di legatura appena preparata a ciascuna piastra per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, seguita da tre lavaggi di due minuti nel tampone A sulla piattaforma inclinabile.
Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 40 microlitri di soluzione di amplificazione appena preparata a ciascuna piastra per un'incubazione di 100 minuti a 37 gradi Celsius in una camera umida. Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule sei volte con tampone B fresco per 10 minuti per lavaggio sulla piattaforma inclinabile. Dopo l'ultimo lavaggio tampone B, lavare le celle una volta con tampone B 0,01x per un minuto a temperatura ambiente prima di etichettare con gli anticorpi secondari appropriati nella camera umida per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con tre lavaggi di 10 minuti su una piattaforma inclinabile in PBST a temperatura ambiente prima di montarli in un mezzo di montaggio integrato con DAPI. Entro quattro giorni dal montaggio, visualizzare almeno 100 osservazioni per campione o condizione di cellule su un microscopio epifluorescenza o confocale, utilizzando le stesse impostazioni di esposizione sia per i campioni sperimentali che per quelli di controllo. Il tag Dig può essere visualizzato mediante immunofluorescenza per rivelare la presenza di legami incrociati interfilamento in tutto il nucleo.
Per visualizzare l'interazione dei replisomi con i collegamenti incrociati interstrand, il PLA può essere applicato per visualizzare la frequenza di associazione di MCM5 e del tag Dig, un'ora dopo l'introduzione del crosslink interstrand. Poiché lo stress di replicazione attiva l'ATR chinasi, anche il PLA tra pMCM due serina 108 e il tag Dig è positivo. I risultati del PLA dai singoli nuclei possono essere presentati in una ricostruzione tridimensionale che consente la visualizzazione di incontri di reticolazione interfilamento replissome in tutto il nucleo.
L'analisi della forcella di replicazione indica che gli incontri di crosslink interfilamento dimostrano un fenomeno di riavvio della replicazione inaspettato, poiché le proteine del complesso GINS non mostrano il segnale PLA con i legami incrociati dell'interfilamento. Al contrario, il test con CD 45 è positivo, indicando che l'altra proteina bloccante è mantenuta. Quando le cellule vengono incubate con un inibitore ATR, il riavvio è completamente soppresso e i PLA GINS Dig sono fortemente positivi.
Il trattamento CSK+R è essenziale per ridurre il segnale di fondo. Assicurati di rivestire le piastre con un adesivo cellulare e di prefissare con 0,1% FA o le celle si staccheranno dalla piastra.
