1 (toni elettronici) L'optogenetica bioluminescente è una tecnologia di piattaforma in cui le sorgenti luminose geneticamente codificate possono visualizzare e controllare le funzioni e le reti biologiche all'interno e tra le cellule. La bioluminescenza raggiunge ogni dominio di rilevamento della luce espresso nella popolazione cellulare bersaglio senza alcun danno tissutale e cellulare da fibre ottiche e un'esposizione prolungata alla luce fisica. Per iniziare, inizia a preparare lo stock di Luciferina sciogliendo cinque milligrammi di CTZ liofilizzato in 250 microlitri del rispettivo solvente.
Garantire la dissoluzione del CTZ lungo le pareti mediante pipettaggio. Mentre si protegge il flaconcino dalla luce diretta, preparare aliquote da 50 microlitri in tubi microcentrifuga neri da 0,5 millilitri e conservare le aliquote a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. Eseguire tutte le ulteriori manipolazioni in una stanza a tenuta di luce in una cappa a flusso laminare illuminata da luce rossa.
Per eseguire una singola stimolazione luminosa a bioluminescenza, preparare una soluzione di lavoro di Luciferina in un terreno di coltura cellulare, poco prima di aggiungere alle cellule ad una concentrazione finale di 100 micromolari. Aggiungere il mezzo contenente Luciferina alle cellule e incubare per la durata desiderata della stimolazione luminosa. Spegnere la luce rossa.
Dopo aver atteso alcuni secondi fino a quando gli occhi non si sono adattati alla completa oscurità, monitorare l'emissione luminosa a occhio. Documentare l'emissione luminosa scattando una fotografia. Terminare la stimolazione luminosa sostituendo il mezzo contenente Luciferina con il mezzo di coltura, quindi lavare le cellule con il terreno di coltura una o due volte per eliminare tutta la Luciferina a seconda della sensibilità dell'esperimento.
Per evitare la perdita cellulare, placcare le cellule su piatti rivestiti di PDL e incubare le cellule. Per eseguire ripetute stimolazioni luminose a bioluminescenza, impostare la camera di imaging delle cellule vive creando un compartimento a tenuta di luce attorno al microscopio di imaging a cellule vive utilizzando una scatola e fogli neri. Assicurarsi di coprire tutte le sorgenti luminose presenti all'interno della stanza.
Impostare il sistema di perfusione con la soluzione desiderata per l'aspirazione e l'uscita della camera che porta a un contenitore per i rifiuti. A seconda del numero di stimolazioni ripetute, aliquotare la soluzione di imaging luciferina funzionante preparata nei tubi microcentrifuga. Posizionare un coverslip con cellule trasfettate nella camera.
Mantenendo la pompa in funzione, rimuovere il tubo di ingresso della pompa dal becher di aspirazione. Immergere rapidamente il tubo di ingresso nella soluzione di Luciferina, mantenendo il tempo di transizione breve per evitare qualsiasi vuoto d'aria nel tubo. Non appena la soluzione di Luciferina è stata ripresa, riposizionare il tubo di ingresso nel becher di aspirazione.
Ripetere la rimozione e l'immersione del tubo di ingresso in Luciferina tutte le volte che è necessario ad intervalli di diversi minuti o ore a seconda del modello fisiologico a cui le cellule dovrebbero essere esposte. Quindi mantenere le cellule in un ambiente protetto dalla luce per 16-24 ore per la trascrizione o la durata fino a quando non viene valutato l'effetto della stimolazione luminosa. Per eseguire l'attivazione della bioluminescenza in vivo, preparare Luciferina prelevando una fiala CTZ da meno 80 gradi Celsius, quindi lasciarla riscaldare a temperatura ambiente nell'area protetta dalla luce.
Per ogni flaconcino contenente 500 microgrammi di CTZ, aggiungere 250 microlitri di acqua sterile usando una pipetta e rimettere il tappo di gomma sul flaconcino. Incubare il flaconcino di vetro ricostituito a bagnomaria temperato a 55 gradi Celsius per alcuni minuti per sciogliere completamente la polvere. Trasferire la soluzione in un tubo microcentrifuga nero e risciacquare le pareti per recuperare tutto il CTZ.
Dopo aver rimosso la quantità di soluzione necessaria, conservare la soluzione rimanente a quattro gradi Celsius. Dopo aver preparato, ricostituito e aliquotato il veicolo in modo simile, preformare la stimolazione della luce a bioluminescenza rimuovendo il volume di Luciferina o veicolo necessario per le dimensioni dell'animale e il percorso di applicazione scelto. Iniettare l'animale con Luciferina o veicolo come progettato.
Per l'attivazione desiderata della ricombinasi durante uno specifico paradigma comportamentale, iniettare l'animale appena prima del test comportamentale. Per la trascrizione fasica, iniettare l'animale ripetutamente per giorni e raccogliere i dati dall'animale stimolato dalla bioluminescenza come progettato. Il sistema di espressione veloce regolato dalla luce e dall'attività ha permesso la trascrizione del gene reporter con un aumento degli ioni calcio intracellulari e della luce.
Il LED blu ha portato a una robusta fluorescenza reporter e l'espressione FLuc è stata determinata da misurazioni di luminescenza dopo l'aggiunta di Luciferina. In un sistema di imaging in vivo, sia LED che CTZ hanno aumentato in modo robusto l'espressione FLuc, mentre la presenza della sola componente del fattore di trascrizione ha provocato un notevole segnale di fondo, probabilmente a causa della proteolisi spontanea. NanoLuc è stato impiegato per la regolazione optogenica attraverso la dimerizzazione CRY/CIB e il fattore di trascrizione fotosensibile EL222.
La bioluminescenza indotta dall'aggiunta di hCTZ alle cellule HEK-293 e la sua rimozione dopo 15 minuti è stata più efficiente di 20 minuti di esposizione ai LED per CRY/CIB e EL222. Non sono state osservate differenze significative nell'efficacia della trascrizione tra i due sistemi quando co-trasfettati con hCTZ, sebbene le proteine di fusione di CRY/CIB fossero più efficienti di EL222. CRY/CIB ha mostrato livelli di fondo costantemente più elevati rispetto a EL222 indipendentemente dalla concentrazione di hCTZ.
È stata testata la bioluminescenza di una Cre ricombinasi split fotosensibile basata sulla proteina VVD LOV iCreV. I risultati dell'applicazione CTZ hanno rivelato che la presenza di CTZ ha aumentato in modo robusto l'espressione sullo sfondo ed è simile all'applicazione LED. L'uso della bioluminescenza per attivare non solo i fotorecettori in movimento di ferro, ma qualsiasi dominio fotosensoriale aggiunge un'altra dimensione alla stimolazione della luce espandendo la manipolazione delle funzioni cellulari su scale temporali e spaziali.
L'optogenetica bioluminescente è stata applicata in cellule e organismi modello. Questi protocolli possono essere personalizzati per testare una vasta gamma di ipotesi dirette in vitro e in vivo.
