In questo video, mostriamo come utilizzare un sistema di punteggio a sette punti per quantificare i cambiamenti nella morfologia dei dendriti neuroni dopaminergici in C.elegans. Attualmente c'è una grande variazione nei metodi analitici per quantificare la neurodegenerazione nei vermi. Inoltre, alcune abilità esistenti si concentrano solo sui corpi cellulari e non sono sensibili a determinati tipi e livelli di danno.
Lo scopo dell'introduzione di questo sistema di punteggio è quello di fornire la capacità di catturare un quadro completo della neurodegenerazione a tutti i livelli di danno e di fornire un sistema universale per supportare la coerenza nella ricerca sulla neurodegenerazione dopaminergica di C.elegans. Qui, dimostreremo come visualizzare i neuroni sotto fluorescenza, assegnare punteggi ai dendriti di quei neuroni e visualizzare in anteprima come visualizzare e interpretare i risultati. Per ogni gruppo sperimentale, pipettare o prelevare da 20 a 30 worm su una piattaforma di imaging compatibile con il microscopio di imaging.
Le piattaforme più comuni includono tamponi di agarose al 2% montati su vetrini con uno slittamento di copertura e piastre a 96 pozzetti contenenti volumi di pozzo pari o inferiori a 100 microlitri di mezzo liquido. Lascia che i vermi paralizzino completamente. Questa tà potrebbe richiedere alcuni minuti.
Caricare la piattaforma di imaging preparata in un microscopio di imaging in grado di acquisire z-stack. Individua la regione della testa del verme prima in campo luminoso, poi sotto una fluorescenza GFP a colore singolo usando il microscopio di imaging. Il worm è mostrato qui in un ingrandimento 400x.
Scorri lo stato attivo per trovare i limiti superiore e inferiore in cui i dendriti sono chiari. Impostarli come limiti superiore e inferiore per l'acquisizione di immagini z-stack. Seleziona la piazzola desiderata.
Qui usiamo un micrometro. Fare clic per acquisire immagini z-stack nel canale di fluorescenza GFP. Per ogni z-stack, aprire il file immagine utilizzando il software del microscopio o un software di analisi delle immagini esterno.
Caricare lo stack nel software e comprimere lo stack in un'unica immagine appiattita. Allineare le immagini tra e all'interno dei gruppi di trattamento manualmente o utilizzando un software di avvolgimento automatico. Lavora con un'immagine neuronale alla volta.
Scegliete uno dei quattro dendriti CEP da valutare per blob, rotture e irregolarità, tra cui curve, attorcigliamenti e curve. Si consiglia di segnare da sinistra a destra quando il naso è nella parte superiore dell'immagine per garantire la ripetibilità nel punteggio. Utilizzando queste linee guida, assegnare un valore di punteggio a ciascun dendrite.
Assegnare un punteggio pari a zero per i dendriti senza danni visibili, un punteggio di uno per i dendriti con irregolarità ma senza macchie o rotture, un punteggio di due per i dendriti con meno di cinque bleb, un punteggio di tre per tra cinque e 10 blebs, un punteggio di quattro per oltre 10 blebs e/o rottura rimuovendo fino al 25% del dendrite, un punteggio di cinque per la rottura rimuovendo dal 25 al 75% del dendrite e un punteggio di sei se più del 75% del dendrite è assente. Se più criteri sono soddisfatti all'interno di un singolo dendrite, considerare i criteri corrispondenti al punteggio più alto. Queste immagini rappresentative di punteggio trovate nella Figura 1 dell'articolo associato a questo video possono essere utilizzate come riferimento.
Per dimostrare il punteggio, esamineremo l'assegnazione di punteggi ad alcune immagini di neuroni di esempio. Inizia con la parte superiore più dendrite, non ci sono blebs visibili, rotture o irregolarità. Assegna un punteggio pari a zero.
Il secondo dendrite ha circa 14 blebs e nessuna rottura visibile. Assegna un punteggio di quattro. Il terzo dendrite non può essere visto nella sua interezza a causa della sovrapposizione con dendrite due e non può essere segnato.
Il dendrite inferiore ha circa 11 blebs e alcune pause. Assegna un punteggio di cinque. In questa immagine, solo tre dendriti sono segnabili, poiché un dendrite non è stato completamente catturato nella cattura z-stack.
Non c'è blebbing sui tre dendriti visibili. Quindi questo sarebbe stato segnato dall'alto verso il basso come uno zero, uno zero e, a causa del nodo qui, uno. Infine, in questa immagine, tutti e quattro i dendriti sono persi per oltre il 75%.
Tutti i dendriti qui ricevono un punteggio di sei. Registra tutti i punteggi. I punteggi potrebbero essere non in blindo in questo momento.
Il modello di punteggio utilizzato qui può essere trovato nei file supplementari. Dividere i conteggi del punteggio di neurodegenerazione per il numero totale di dendriti segnati nel gruppo di trattamento. Presentare i dati come proporzione di dendriti all'interno del gruppo di trattamento a ciascun punteggio di neurodegenerazione.
Il nostro sistema di punteggio è stato utilizzato per valutare la neurodegenerazione nello stadio larvale L4 BY200 C.elegans dopo l'esposizione al rotenone. I dati vengono visualizzati qui come con le proporzioni del numero totale di dendriti a ciascun valore di punteggio per ciascun gruppo sperimentale. Consideriamo ogni dendrite punteggiato come n 1.
In questa figura, è possibile apprezzare una risposta neurodegenerativa dose-dipendente all'esposizione al rotenone e la ripartizione specifica della distribuzione del punteggio viene visualizzata chiaramente. Questi gruppi sperimentali erano statisticamente diversi secondo un test di indipendenza del Chi quadrato integrato da una correzione di Bonferroni per confronti multipli. In questo video, abbiamo dimostrato come utilizzare la scala a sette punti sviluppata nel nostro laboratorio per quantificare i livelli di alterazione morfologica e degenerazione morfologica dei neuroni dopaminergici in C.elegans.
L'utilizzo del metodo di punteggio promuove la coerenza nell'analisi e consente il confronto tra studi di ricerca sulla neurodegenerazione nei vermi. Il nostro sistema di punteggio può essere utilizzato per analizzare i dati derivati da esperimenti C.elegans che utilizzano reporter fluorescenti specifici per le cellule, come il gene trasportatore della dopamina dat-1 che consente la visualizzazione dei neuroni dopaminergici. Ora, si prega di trovare un set di immagini con commento che può essere utilizzato per addestrare, calibrare e valutare la coerenza del punteggio dei ricercatori nuovi a questo metodo nel materiale supplementare di questo articolo.
