La tecnica Flow-Enhanced Ultrasound ci permette di fotografare la vascolarizzazione dell'occhio in tre dimensioni, senza l'uso di mezzi di contrasto. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua stabilità nell'immagine della veste, dietro la retina pigmentata, che è impegnativa con diverse tecniche di imaging ottico. Dimostriamo questa tecnica nel pesce rosso, ma può essere applicata a tutte le specie con globuli rossi nucleati, consentendo ai ricercatori di ottenere informazioni sull'evoluzione funzionale degli occhi.
Questa tecnica può essere applicata da ricercatori con una formazione di base nell'imaging ad ultrasuoni e nella manipolazione degli animali. Dopo aver confermato un livello ottimale di anestesia, posizionare l'animale in una postura che consenta l'accesso diretto dall'alto, all'occhio. Posizionare un mezzo ad ultrasuoni adatto sull'occhio dell'animale.
Se le palpebre squamate coprono l'occhio, quindi, spostale delicatamente con un batuffolo di cotone. Per gli animali acquatici, l'acqua funziona bene come mezzo ad ultrasuoni, Successivamente, posizionare il trasduttore ad ultrasuoni, mediale all'occhio, in un orientamento caudale ventrale dorsale o rostrale, a seconda dell'orientamento dell'immagine desiderato. In modalità B, con una profondità di campo massima, visualizza la porzione mediale e più profonda dell'occhio, per assicurarti che tutte le strutture di interesse siano visibili nel campo immagine.
Traduci lentamente il trasduttore su ciascun lato, mentre ispeziona le immagini in tempo reale. Assicurati che tutte le strutture di interesse siano visibili nel campo dell'immagine. In caso contrario, passare a un trasduttore con una frequenza inferiore e una maggiore profondità di campo.
Regola la profondità dell'immagine, l'offset di profondità, la larghezza dell'immagine e il numero di posizioni delle zone focali, per coprire la regione di interesse desiderata in tutte e tre le dimensioni spaziali. Quindi, imposta la frequenza dei fotogrammi nell'intervallo da 50 a 120 fotogrammi al secondo. Successivamente, regolare il guadagno 2D a un livello tale che le strutture anatomiche siano appena visibili nell'acquisizione B-Mode per aumentare il rapporto segnale/rumore nella successiva ricostruzione potenziata dal flusso.
Per acquisire un'immagine 2D ottimizzata dal flusso in una singola posizione slice, tradurre il trasduttore in questa posizione e procedere alla ricostruzione dell'immagine ottimizzata per il flusso. Per acquisire una registrazione 3D di un'intera regione di interesse, tradurre il trasduttore a un estremo della regione di interesse. Per determinare la posizione esatta dell'estremità estrema, aumentare brevemente il guadagno 2D.
Dopo che il trasduttore è stato posizionato correttamente, abbassare il guadagno 2D prima della registrazione, per garantire il massimo rapporto segnale/rumore nella successiva ricostruzione potenziata dal flusso. Per ogni passo o fetta nella registrazione 3D, acquisire più di 100 fotogrammi. Quindi, utilizzando un micropolatore o un motore trasduttore incorporato, tradurre il trasduttore attraverso l'intera regione di interesse, in passi di 25 o 50 micrometri, e ripetere l'acquisizione di oltre 100 fotogrammi per ogni passaggio.
Per una costruzione di immagini ottimizzata dal flusso, esportare le registrazioni nel formato di file DICOM. Per produrre una singola immagine ottimizzata per il flusso basata su una registrazione di scena superiore a 100 fotogrammi, calcolate la deviazione standard a livello di pixel utilizzando questa formula e ripetete il calcolo per ogni sezione nella registrazione 3D. Per automatizzare il calcolo della deviazione standard e il processo di ricostruzione dell'immagine per più sezioni in una registrazione 3D, eseguire questa operazione in modalità batch utilizzando ImageJ e lo script macro, fornito nel manoscritto di testo.
Combina tutte le immagini ricostruite in un'unica pila di immagini utilizzando il comando Immagini da impilare in ImageJ. Quindi, utilizzando il comando Proprietà, specifica lo spessore della sezione dalla dimensione del passo utilizzata durante l'acquisizione e salva lo stack di immagini come file TIFF 3D. La presenza di globuli rossi nucleati in vertebrati di mammiferi adulti non pubblicitari fornisce un contrasto positivo del sangue che scorre, rispetto al tessuto statico nelle registrazioni delle scene.
Tuttavia, quando ora analizzato fotogramma per fotogramma, la chiara distinzione tra sangue e tessuto circostante è meno ovvia. Questa procedura di miglioramento del flusso sanguigno, essenzialmente, compila una registrazione multi-punto nello spazio 2D, in una singola immagine, dove nella fluttuazione intrinseca del valore del segnale in pixel, posizionati nel sangue che scorre, segna una deviazione standard più elevata, rispetto al tessuto statico circostante, producendo un contrasto positivo. Nelle acquisizioni 3D, più sezioni parallele con spaziatura nota possono essere combinate in dati di immagine 3D.
Può essere utilizzato per il rendering tridimensionale del volume e la modellazione anatomica. L'imaging a ultrasuoni basato su Doppler offre anche la possibilità di visualizzare specificamente il flusso sanguigno, tuttavia, con meno sensibilità rispetto a questo metodo. Questa procedura ecografica potenziata dal flusso consente l'imaging del flusso sanguigno in una serie di specie con globuli rossi nucleati.
Letti vascolari oculari profondi, come la rete mirabile coroide in alcuni pesci, possono essere ripresi se presenti nella specie. Il metodo è limitato dall'assenza di globuli rossi nucleati nei mammiferi, in cui la procedura di miglioramento del flusso produce un certo grado di contrasto del flusso sanguigno, ma non così distinto come nelle specie con globuli rossi nucleati. Gli ultrasuoni potenziati dal flusso sono sensibili al rumore del movimento.
I movimenti respiratori possono causare sfocatura dell'immagine e artefatti, come il miglioramento del bordo dei tessuti. Il gating prospettico o retrospettivo può essere utilizzato per regolare il rumore del movimento. Sia per le acquisizioni 2D che 3D, è fondamentale limitare gli artefatti di movimento causati dall'animale in movimento, a causa di un'anestesia inadeguata su un trasduttore instabile impostato.
Lo sviluppo di questa tecnica, ha aperto la strada all'esame in vivo non invasivo delle reti vascolari profonde nell'occhio della stragrande maggioranza dei vertebrati, che possiedono eritrociti nucleati.
