Questo protocollo aiuta a verificare l'esistenza di Wolbachia nelle cellule, che è la base per comprendere l'interazione tra Wolbachia e il suo ospite. In questo protocollo, sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare con successo l'infezione intracellulare da Wolbachia, che ha corroborato e migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione delle cellule di Wolbachia. A dimostrare la procedura sarà Qiuqiu Xiao, un post-laurea del Key Laboratory of Modern Pathogen Biology and Characteristics.
Inizia osservando le cellule Aa23 e Aa23-T non macchiate con ingrandimento 100x usando la microscopia ottica. Coltivare le cellule per cinque-sette giorni per raggiungere il 70-80% di confluenza per pallone. Utilizzando una pipetta, trasferire 1 mL del terreno di coltura in un tubo di microcentrifuga.
Centrifugare a 100 RCF per cinque minuti per raccogliere le cellule. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet cellulare risultante a meno 20 gradi Celsius. Coltivare le cellule per cinque-sette giorni per raggiungere il 90-100% di confluenza per pallone.
Sospendere il pellet in 0,40 ml di PBS e trasferire 50 microlitri di questa soluzione in un tubo microcentrifuga. Aggiungere cinque microlitri di 20 mg/mL di proteinasi K e incubare a 55 gradi Celsius per un'ora. Quindi incubare i tubi a 99 gradi Celsius per 15 minuti per ottenere il DNA grezzo e conservarlo a meno 20 gradi Celsius.
Per eseguire la PCR, preparare una miscela di reazione totale di 20 microlitri e impostare le condizioni pcr come descritto nel manoscritto di testo. Rileva il DNA su un gel di agarosio all'1% usando un imager in gel. Eseguire l'amplificazione QUANTITATIVA PCR utilizzando TB Green in un sistema PCR in tempo reale e registrare i risultati di ogni reazione.
Analizzare il DNA in un volume di reazione totale di 20 microlitri e impostare le condizioni quantitative di PCR come descritto nel manoscritto di testo. Calcola i numeri di copia del gene WSP e RPS6 nelle cellule secondo la curva standard stabilita. Quindi calcolare la densità relativa di Wolbachia in base al numero di copie di wsp/RPS6.
Analizzare i dati utilizzando un t-test di campioni indipendenti. Aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi al pellet cellulare e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare i lisati a 12.000 RCF per 10 minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il surnatante.
Analizzare la concentrazione di wsp del surnatante utilizzando un kit di analisi delle proteine BCA, seguendo le istruzioni del produttore. Carica quantità uguali di proteine su un gel SDS-PAGE al 15%. Trasferire la proteina alle membrane nitrocellulosiche e bloccare le membrane con latte scremato al 5% per due ore a temperatura ambiente.
Quindi lavare le membrane tre volte con TBST. Incubare le membrane durante la notte a 4 gradi Celsius con 100 microlitri di anticorpo policlonale anti-wsp preparati diluendo l'anticorpo primario con il 5% di latte scremato. Lavare l'anticorpo primario tre volte con TBST.
Aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano alle membrane e incubarlo su uno shaker per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le membrane tre volte con TBST e mescolare 20 microlitri di soluzione A e 20 microlitri di soluzione B nel kit di rilevamento della chemiluminescenza con un rapporto di uno a uno. Immergere contemporaneamente l'intera membrana nella soluzione di luminescenza e osservare i segnali utilizzando un sistema di imaging multifunzionale.
Su una capsula di Petri confocale laser, incubare le cellule Aa23 e Aa23-T per tre o quattro giorni a 28 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica atmosferica. Quando la cellula raggiunge il 60-70% di confluenza, lavare le cellule tre volte con PBS. Fissare le cellule in un mL di paraformaldeide al 4% per 20 minuti a quattro gradi Celsius.
Lavare le celle fisse usando PBST per cinque minuti e lavare nuovamente le cellule due volte con PBS. Incubare la capsula di Petri in un mL di albumina sierica bovina al 3% per un'ora a 37 gradi Celsius. Aggiungere 100 microlitri di anticorpi policlonali anti-wsp di topo e siero di topo ai vetrini e incubarlo durante la notte in una scatola bagnata a quattro gradi Celsius.
Rimuovere la capsula di Petri dalla scatola bagnata e riportarla a temperatura ambiente. Lavarli tre volte con PBS e rimuovere il PBS. Proteggere le seguenti procedure dalla luce.
Incubare la capsula di Petri con 100 microlitri di un anticorpo anti-topo di capra coniugato Alexa Fluor 488 a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Incubare la capsula di Petri campione con 50 microlitri di DAPI diluiti in PBS a 10 microgrammi/ml a 37 gradi Celsius per cinque minuti e poi lavarli tre volte con PBS. Osservare l'immunocolorazione al microscopio confocale.
Prima di rilevare Wolbachia, le cellule Aa23 e Aa23-T sono state osservate al microscopio ottico per determinare le differenze morfologiche tra le due linee cellulari. Le cellule Aa23 e AA23-T avevano almeno due morfologie cellulari, ma non sono state osservate apparenti differenze morfologiche tra i due tipi di cellule. Utilizzando i primer diagnostici 81F/691R, l'amplificazione positiva del gene Wolbachia wsp è stata rilevata nelle cellule Aa23 ma non nelle cellule Aa23-T.
L'analisi della densità di Wolbachia nelle linee cellulari ha mostrato un rapporto wsp/rps6 di 2,4 nelle cellule Aa23 ma nessun Wolbachia nelle cellule Aa23-T. L'analisi Western blot degli estratti proteici ha mostrato un forte segnale wsp per Aa23, ma nessun segnale è stato rilevato per Aa23-T. Il test di immunofluorescenza indiretta ha rilevato la proteina wsp nelle cellule Aa23, mentre solo il DNA colorato con DAPI è stato rilevato nelle cellule Aa23-T.
Assicurarsi che i palloni di coltura siano incubati a 28 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica atmosferica per cinque-sette giorni. Questa procedura può essere seguita dalla microscopia elettronica in cui è necessario prestare particolare attenzione alla preparazione del campione e al sezionamento. I quattro metodi sperimentali utilizzati in questo studio hanno confermato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione da Wolbachia nelle cellule, che è applicabile anche ad altri tipi di cellule e tessuti.
