Questo protocollo delinea le tecniche utilizzate per produrre il virus della malattia di Newcastle in modo che possa essere somministrato in modo sicuro a topi e altri animali come criceti e pecore. L'uso della filtrazione a flusso tangenziale consente di elaborare grandi volumi di partenza in modo più efficiente rispetto alle procedure esistenti che utilizzano solo processi di centrifugazione. Questa è una procedura lunga che coinvolge diversi passaggi intricati, il che significa che la gestione del tempo può essere un problema.
Consiglierei di identificare tutti i potenziali passaggi di pausa in modo che la tecnica possa essere suddivisa in modo appropriato, riducendo al minimo lo stress. A dimostrare questa procedura sarà Alex, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Per la purificazione del virus della malattia di Newcastle o NDV, in primo luogo, innescare il sistema sperimentale precedentemente impostato eseguendo 50 millilitri di PBS attraverso di esso.
Arrestare la pompa quando nel tubo rimangono circa cinque millilitri di PBS. Quindi, collegare un filtro di profondità con un valore di ritenzione da uno a tre micromolari al tubo. Per sfiatare il filtro, rimuovere il secondo tappo sul lato epico del filtro di profondità, quindi iniziare a far funzionare altri 50 millilitri di PBS attraverso il sistema.
Una volta che il PBS inizia a fluire attraverso lo sfiato nella parte superiore del filtro, chiudere la porta e continuare a far fluire PBS attraverso le linee. Successivamente, sostituire il contenitore dei rifiuti con un nuovo recipiente di raccolta sterile e iniziare a far scorrere il fluido allantoico attraverso il filtro di profondità. Quindi, impostare la filtrazione a flusso tangenziale o il sistema TFF in una conferma aperta ed eseguire come descritto nel manoscritto.
Quando ci sono circa cinque millilitri di fluido rimasti nel serbatoio, mettere in pausa la pompa e aggiungere fluido allantoico filtrato in profondità al serbatoio. Quindi riprendere il flusso della pompa. Per prevenire la tosatura del virus, è importante assicurarsi che la pressione del sistema non superi la forza di 10 libbre per pollice quadrato.
Per aumentare l'illusione, è necessario utilizzare una combinazione della velocità della pompa peristaltica e del morsetto a C. Da 150 a 100 millilitri di liquido allantoico vengono lasciati nel serbatoio, mettere in pausa la pompa e sostituire il buffer aggiungendo da 150 a 200 millilitri di tampone ML. Ancora una volta, mettere in pausa la pompa quando da cinque a 10 millilitri di fluido sono rimasti nel serbatoio, quindi utilizzando due morsetti a C chiudere la vita.
Disaccoppia la linea retented che alimenta il serbatoio e inseriscila in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi riprendere il flusso e mettere in pausa quando ci sono poche gocce di liquido rimaste nel serbatoio del serbatoio. Quindi, rimuovere i morsetti a C dalle linee di scarico e ricollegare la linea di alimentazione ritentata al serbatoio del serbatoio.
Nel frattempo, per prepararsi all'ultracentrifugazione del gradiente di densità dello iodixanolo, aggiungere prima un 0,5 millilitri di 40% iodixanolo a un tubo ultra centrifugo a parete sottile a parete sottile aperto da 13,2 millilitri. Quindi preparare la colonna con aggiunte successive di 2,5 millilitri di 20% iodixanolo e 2,5 millilitri di 10% iodixanolo. Prima dell'ultracentrifugazione, aggiungere con attenzione da sei a 6,5 millilitri della soluzione virale allusa dal sistema TFF alla colonna di iodixanolo senza disturbare il gradiente.
Dopo l'ultracentrifugazione, rimuovere i tubi con un paio di pinze sterili. La banda target dovrebbe essere una banda larga tra i gradienti del 10 e del 20%. Quindi, sospendere il tubo sopra la parte superiore di un becher usando un supporto di storta.
Successivamente, collegare un ago da 1,5 pollici di calibro 18 a una siringa da cinque millilitri, quindi perforare il lato del tubo ultracentrifuga con l'ago e rimuovere la fascia target estendendo lentamente lo stantuffo. Dopo aver rimosso lo iodixanolo dalla soluzione del virus come descritto nel manoscritto, utilizzare una siringa per iniettare con cura il virus in una cassetta di dialisi. Per concentrare la soluzione virale, rimuovere la cassetta di dialisi dal tampone di dialisi e metterla in un piccolo sacchetto di plastica sigillabile.
Quindi aggiungere un 15-25 millilitri di polietilenglicole al 40% al sacchetto in modo che la cassetta di dialisi sia completamente sommersa. Dopo la dialisi, sciacquare brevemente la cassetta di dialisi con PBS. Quindi, riempire una siringa dotata di aria con un ago da 1,5 pollici di calibro 18, inserire la siringa nella cassetta di dialisi e spingere lo stantuffo.
Ruotare l'apparecchio per rimuovere il virus senza rimuovere l'aria introdotta. Per rimuovere il virus residuo aderente alla membrana, massaggiare accuratamente la membrana con le dita guantate senza danneggiarla. Per facilitare il processo di spostamento, rimuovere parte dell'aria in eccesso nella cassetta di dialisi.
Per i test di controllo qualità, in primo luogo, diluire la soluzione virale 100 volte aggiungendo 10 microlitri di essa a 990 microlitri di PBS in un tubo da 1,5 millilitri. Quindi continuare la diluizione seriale aggiungendo 100 microlitri della diluizione precedente a 900 microlitri di PBS. Per i test di infezione, aggiungere 20 microlitri di ogni delirio a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti.
Prima di esaminare l'effetto citopatico della proteina di fluorescenza verde o di eseguire un test di immunofluorescenza indiretta, incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per almeno 48 ore. Utilizzando questo protocollo, è stato ottenuto un NDV altamente purificato, come dimostrato dall'elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio e solfato delle proteine virali. L'infettività del virus purificato con questo metodo è stata verificata anche dalla dose di infezione da coltura tissutale del 50% o dal test TCID50 eseguito in 96 piastre di pozzo.
Il TCID50 è stato determinato dal numero di pozzi positivi per ogni diluizione utilizzando il calcolatore Spearman-Karber. Il test di infezione ha rivelato la differenza tra gli effetti citopatici dell'NDV lentogeno e mesogenico sulle cellule DF one in condizioni diverse dopo 10 e 24 ore di incubazione. Il test immuno florence è stato efficace anche nello studio dell'infezione delle cellule Vero da NDV lentogeno.
Quando si innesca il sistema sperimentale, assicurarsi che le linee siano innescate in modo efficace poiché qualsiasi idrossido di sodio residuo inattiverà il virus. Inoltre è importante mantenere l'integrità della membrana in quanto compromettere questo comprometterà significativamente la purificazione e la resa del virus.
