Le varianti strutturali come inserzioni, delezioni, duplicazioni e inversioni sono state in passato più difficili da seguire sperimentalmente e le loro frequenze non possono essere misurate con precisione dal sequenziamento dell'amplicone. Qui forniamo una tecnica semplice ed economica, che accoppia il design del primer triplo e l'elettroferesi capillare parallela per seguire le frequenze degli alleli varianti strutturali nel tempo. Questo metodo è stato progettato per integrare il sequenziamento degli endpoint nell'evoluzione sperimentale e per ritracciare le frequenze degli alleli de novo emergenti.
Speriamo che questo metodo possa anche avvantaggiare coloro che lavorano con i dati sui patogeni intra ospiti. A dimostrare la procedura sarà Jeanne Hamet, assistente di ricerca del nostro laboratorio. Le diverse fasi dei metodi saranno mostrate in un caso in cui l'allele derivato risulta da un'inserzione IS10 in un gene batterico chiamato mutS.
Per prima cosa progetta una coppia di primer per amplificare un breve amplicone sull'allele wild type attorno al sito di inserimento mutante. Progettare un terzo primer forward primer due all'interno della sequenza di inserimento per produrre una leggera variabile di dimensione dall'amplicone wild type. Inizia estraendo il DNA da colture di 24 ore di cloni allelici selvatici e mutanti fissi.
Dopo aver quantificato il DNA, diluire ogni estratto di DNA a cinque nanogrammi per microlitro con acqua. Fissare i due campioni in un rapporto 50/50. Impostare una reazione da 20 microlitri contenente 10 nanogrammi di campione di DNA, primer e master mix PCR.
Quindi, separare il prodotto PCR mediante elettroforesi, utilizzando un gel di agarosio al 2%. La differenza di dimensioni tra gli ampliconi del tipo selvatico e il mutante deve essere verificata sul gel. Per ottenere una curva di calibrazione, iniziare mescolando il DNA wild type e il DNA mutante in vari rapporti.
Diluire i prodotti PCR a 0,1 nanogrammi per concentrazione di microlitro. Per preparare il gel di separazione, mescolare il gel fresco e colorare. Sostituire il buffer di ingresso.
Posizionare il tampone di risciacquo nella corretta posizione del cassetto dello strumento di elettroforesi capillare parallelo. Aggiungere 22 microlitri del marcatore di diluente ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Ora aggiungi due microlitri di prodotti PCR diluiti a ciascun pozzetto del campione.
A uno Bene, aggiungi una scala di dimensioni del DNA da un kit ad alta sensibilità, che va da una a 6.000 coppie di basi di dimensioni. Posizionare la micropiastra nello strumento di elettroforesi capillare parallela in esecuzione selezionata sul software dello strumento. Analizza i risultati utilizzando il software di analisi dei dati.
Innanzitutto, identifica i picchi in base alle loro dimensioni note. Quantificare ogni amplicone per produrre una curva di calibrazione. Infine, verificare che le quantità relative dei due alleli siano misurate correttamente.
Questa curva di calibrazione viene quindi utilizzata per calcolare la quantità di varianti strutturali dopo l'amplificazione PCR e l'elettroforesi capillare parallela. Questi risultati rappresentativi seguono un'inserzione dirompente nel gene mutS. Knockdown e mutS portano a un fenotipo ipermutatore, consentendo ai batteri di campionare più mutazioni rispetto al loro tasso di mutazione di base.
Utilizzando il metodo presentato, la frequenza della variante strutturale mutS è stata tracciata attraverso 1000 generazioni. È stata rivelata una traiettoria non monotona dell'allele mutante emergente. L'allele mutante è stato rilevato per la prima volta alla generazione 680.
L'allele è poi aumentato rapidamente in frequenza, raggiungendo il 67% dalla generazione 713. Questo aumento è poi rimasto stagnante, aumentando solo del 10% nelle successive 53 generazioni, al 76% Inaspettatamente, la frequenza dell'allele mutante è poi diminuita dal 76% al 49% nel corso di 13 generazioni, dopo di che è aumentata fino alla fissazione. Questo metodo andrà a beneficio di coloro che lavorano sull'evoluzione sperimentale.
Questo protocollo consente all'utente di prendere archivi congelati ed esplorare traiettorie evolutive che altrimenti non sarebbero osservabili con i dati di sequenziamento degli endpoint.
