Questo protocollo per determinare le dimensioni della covata e la vitalità embrionale è utilizzato da molti laboratori di C.elegans. La diminuzione delle dimensioni brute e della vitalità embrionale può indicare difetti in importanti processi di sviluppo come la miosi, la fecondazione e l'embriogenesi. Questa tecnica fornisce istruzioni chiare per i ricercatori principianti di C.elegans.
È relativamente semplice da configurare ed eseguire ed è un ottimo punto di partenza quando si lavora con nuovi ceppi mutanti. La sfida più grande per questa tecnica è l'identificazione dell'embrione rispetto all'embrione non fecondato. I nuovi ricercatori dovrebbero praticare l'identificazione di embrioni, ovociti e i diversi stadi larvali prima di iniziare questi esperimenti.
Per iniziare, etichettare il retro della piastra, trasferire un singolo ermafrodito allo stadio L4 fino alla piastra. Assicurarsi che nessun embrione o altro verme venga trasferito sulla piastra. Lasciare che i vermi si sviluppino in adulti e deporre la progenie per 24 ore alla temperatura di coltura standard di 20 gradi Celsius.
Segna il piatto il terzo giorno. Il giorno successivo, etichettare un set di nuove piastre e trasferire il singolo verme del giorno sulla nuova piastra. Lasciare che i vermi depongano embrioni per 24 ore a 20 gradi Celsius.
Segna il piatto il quarto giorno. Il terzo giorno, etichettare una serie di nuove piastre e trasferire il giorno due singoli vermi sulla nuova piastra. Lascia che i vermi depongano la progenie per 24 ore a 20 gradi.
Segna il piatto il quinto giorno. Disegna un motivo a griglia su un coperchio di 35 millimetri usando un pennarello fine. Posizionare il coperchio grigliato sotto la piastra di prova per il conteggio per tenere traccia dei vermi precedentemente contati.
Utilizzando un contatore di cellule differenziali, contare le larve vive e gli embrioni non schiusi all'interno del singolo quadrato. Per i vermi sui bordi quadrati contare in base alla posizione della testa del verme. Conta i vermi con le teste che toccano i bordi superiore e sinistro del quadrato.
Registrare il numero di larve vive ed embrioni non nati in un quaderno di laboratorio. Il quarto giorno, segna la piastra del secondo giorno contando le larve vive e gli embrioni non nati e registrandoli in un quaderno di laboratorio. Il quinto giorno, segna la piastra del giorno tre contando le larve vive e gli embrioni non schiusi e registrali in un quaderno di laboratorio.
Dopo aver etichettato il retro della piastra, trasferire un singolo verme ermafrodita L4 sulla piastra. Assicurarsi che nessun embrione o altro verme venga trasferito sulla piastra. Trasferire un singolo verme maschio L4 sulla piastra contenente un L quattro ermafrodito.
Lasciare che i vermi si accoppiano e depongano la prole per 24 ore a 20 gradi Celsius. Segna il piatto per le larve vive rispetto agli embrioni non schiusi il terzo giorno. Il giorno dopo, etichetta una serie di nuove piastre e trasferisci l'ermafrodita e il maschio sulla nuova piastra.
Assicurarsi che l'ermafrodita abbia raggiunto l'età adulta. Permettere agli ermafroditi di deporre la progenie per 24 ore a 20 gradi Celsius. Segna il piatto per le larve vive rispetto agli embrioni non nati il quarto giorno.
Il terzo giorno, etichetta una serie di nuove piastre e trasferisci l'ermafrodita e il maschio sul nuovo piatto. Lascia che i vermi depongano la progenie per 24 ore a 20 gradi. Assegna un punteggio al piatto per gli embrioni vivi rispetto a quelli non schiusi il quinto giorno.
Utilizzando un contatore di cellule differenziali, contare le larve vive e gli embrioni non nati dal piatto del primo giorno e registrarli in un quaderno di laboratorio. Il quarto giorno, conta la progenie viva e gli embrioni non nati dalla piastra del secondo giorno e annotali in un quaderno di laboratorio. Controlla il piatto del giorno uno per i maschi.
Se si è verificato l'accoppiamento, il rapporto genetico atteso tra ermafroditi e maschi è compreso tra 50 e 50. Se il giorno uno piatto non contiene maschi, l'accoppiamento tra il maschio e l'ermafrodito non si è verificato. Scartare questa coppia di accoppiamento e registrare l'osservazione nel quaderno di laboratorio.
Il quinto giorno, conta le larve vive e gli embrioni non schiusi della piastra del giorno tre e annotali in un quaderno di laboratorio. Il test di vitalità embrionale per N2 ha prodotto una percentuale di vitalità del 98,9%, mentre sia him-5 (e1490) che spo-11 (ok79) hanno mostrato una riduzione della vitalità embrionale con una percentuale rispettivamente del 74,9% e dello 0,8%. La dimensione media della covata di N2, him-5 (e1490) e spo-11 (ok79) è stata determinata rispettivamente in 217, 105 e 219.
Il riconoscimento delle varie fasi dello sviluppo di C.elegans è importante per dati accurati e riproducibili. Si consiglia di acquisire familiarità con lo sviluppo di vermi utilizzando immagini e un microscopio da dissezione. Questa procedura è un ottimo primo passo per determinare se un gene è coinvolto in un processo di sviluppo e può essere seguita da analisi citologiche per determinare quale processo viene interrotto.
