ゼブラフィッシュ精子の凍結保存用ハイスループット法とインビトロ受精

要約

これは、ゼブラフィッシュのためのハイスループット精子の凍結保存プロトコルです。精子は、このプロトコルを使用すると、その後の体外受精で25％の肥沃度の平均値を持ち、長年にわたって安定な凍結保存。

要約

これはハーヴェイの方法（ハーヴェイら、1982）の適応であるゼブラフィッシュの精子の凍結保存のための方法です。我々は両方の手順を合理化し、サンプルの均一性を高めること、元のプロトコルには2つの変更を導入している。まず、凍結保護剤を含まない凍結​​メディアを使用して、すべての精子の量を正規化する。第二に、凍結保存精子の代わりに毛細管のcryovialsに格納されています。 （δ° C /時間）凍結融解精子の率は、おそらくこの手順で制御するには二つの最も重要な変数です。このような理由から、指定されたもののために別のチューブを代用しないでください。 2のチームで作業すること約2時間でチームあたり100人の男性の精子を凍結することが可能です。精子は、このプロトコルを使用すると25％の肥沃度の平均を持っている（受精卵の総数で割った値で体外受精で生成された実行可能な胚の数として測定される）、このパーセントの出生率が長年にわたって安定な凍結保存。

プロトコル

パート：精子凍結ソリューション

1。ギンズバーグフィッシュリンガー（3日ごとに新鮮な確認、ギンズバーグ、1963）

注：添加の順序は、沈殿を防止することが重要です

450にmlの滅菌ddH2Oに溶解する：

• 塩化ナトリウム3.25グラム
• 塩化カリウム0.125グラム
• 塩化カルシウム•2 H2O 0.175グラム
  その後、追加します。
• NaHCO3水溶液0.10グラム

4℃で滅菌ddH2Oと店舗℃で500 mlに最終容量をもたらす

2。凍結培地（新鮮な毎日を作る）

1. メタノールなし
   • ギンズバーグの魚は10mlリンゲル（室温を。）
   • 脱脂粉乳1.5 GM
2. メタノールで
   
   注：添加の順序は、沈殿を防止することが重要です
   
   
   • ギンズバーグの魚は9ミリリットル（室温を。）リンガーズ
   • メタノール1ミリリットル
   • 脱脂粉乳1.5グラム
   
   凍結媒体を組み立てた後、20分間よく混ぜる。オービタルシェーカーまたはロッカーで。ご使用になる前に、1mlのエッペンドルフチュー​​ブに分注し、表面の気泡を回避。
   

パートB：精子の凍結に必要な材料

精子の凍結に必要な材料

1. 10μlの使い捨てピペット（Fisherbrandの猫＃22から358697）
2. MESAB / Tricaineを含む魚の水の250ミリリットルのビーカー
3. 時計メガネ（パイレックスの猫＃9985〜75）
4. P20 pipetman（または同等）とヒント
5. スポンジの魚ホルダー（スクイーズしながら男性を保持する）
6. 上記の舞台照明付き実体顕微鏡
7. フラットピンセット（例えばミリポアタイプ）
8. 2.0ミリリットルクライオバイアル（コーニング猫＃430488）
9. 10 × 10 cryoboxes（Nalgene猫＃03から337 - 7AA）
10. 発泡スチロール容器は、細かく破砕乾燥ice1の〜15 Cmを埋め
11. 15 mlコニカルチューブ（ファルコン＃352099）
12. 液体窒素を含有するデュワーフラスコ
13. 長いトング（例：CMSフィッシャーヘルスケア猫＃10 - 316B）
14. Cryogloves
15. 男性のための回収タンク
16. メタノールなく凍結媒体を充填した1エッペンドルフチュー​​ブ
17. メタノールによる凍結培地を充填した1エッペンドルフチュー​​ブ
18. Cryofreezer（例えばテイラー - ワルトンK -シリーズ）

¹細かく砕いたドライアイスを作るための簡単な方法は、タオルでそれをラップし、ハンマーで粉砕することです。より効率的な方法は、ドライアイスのグラインダー、たとえばクローソンモデルRE - 2を使用することです。

パートC：精子凍結法

1. キャピラリーチューブをマーク：前初めに、（底部からすなわち16.7ミリメートルを、図を参照してください1.1。）3.33μlのレベルで研究室のペンで10μlのキャピラリーチューブをマーク。
2. 男性の麻酔：MESAB / tricaineを入れたビーカーに配置男性（s）は魚の水（"ゼブラブック"のレシピ）で希釈し
3. DRY FISH：一度麻酔は、プラスチックのスプーンを使用して麻酔薬の魚アウトを持ち上げ、ゆっくりと腹側を乾燥するために特別な注意を払って、ペーパータオル上で乾燥した魚を汚点。それは徹底的に排出腔の周囲に乾燥することが重要ですので、水は精子を活性化する。スポンジホルダーの位置の魚、腹側を上（図1.2）。しりびれ周辺地域は、依然としてキムワイプで軽く乾燥し、湿ったである場合。途中で精子を押さないように注意してください！
4. 場所は、キャピラリーチューブに含まれているゴム製の口のピペットアダプタにキャピラリチューブをマーク。アダプタは一端のマウスピースや他のオンキャピラリーホルダーを持っているゴム製のホースです。また、キャピラリーチューブは、適切な直径のタイゴンチューブの短い断片を経由して50μlのハミルトンシリンジに接続することができます。
5. 範囲で男性を置き、慎重に離れて毛細管の端を使用して骨盤のフィンを分散することで、泌尿生殖器の開口部を公開します。
6. 精子を収集します。穏やかに滑らかな鉗子（例えば、ミリポア社）で魚の側面をなでることによって精子を排出するか、そっと人差し指と親指の間に魚の側面を絞って。それは穏やかな吸引（図1.2）を使用して追放されているキャピラリーチューブで精子を回収します。精子で追放されることがあります糞を避けてください。
7. μlを3.3〜精子の音量を標準化：精子の下流のボリューム、または、キャピラリチューブ（すなわち16.7ミリメートル以上）のペンのマークを超えている場合は、手順8に進みます。精液の容積は、ターゲットボリュームに到達しない場合には、メタノール（図1.3）することなく凍結培地を使用してペンのマークに音量を正規化する。許容される精子の最小量は、精子の質によって異なります。良い精子は白と不透明です。悪い精子は水っぽく見えます。 1μlの良い精子（または1 / 3目標）と2μlの悪い精子（または2 / 3ターゲット）：一般的に、我々は最小値として受け入れます。ボリュームは現在3.3μlに正規化されます。
8. 精子を凍結保護剤を追加：Mで凍結培地を吸い取るオレンジ色のマーク（。。図1.4約総量は現在20μlの場合）にエタノール。気泡を導入しないように特別な注意を払って、時計のガラスのきれいな部分に精子と凍結保護剤混合物​​を排出する。穏やかにピペッティングして混合し、ダウン〜4回（気泡を導入しないように）。
9. 2 CRYOVIALSのそれぞれに10μlの精子を置きます：精子のピペットで10μlの：関連情報（図1.5）で標識された2つの別個のcryovialsの底部に凍結保護剤のソリューション。 、すぐにキャップバイアルを移動し、室内温度15 mlのFalconチューブ一クライオバイアル/チューブの底にそれらをドロップします。キャップファルコンチューブと砕いたドライアイスにクライオバイアル含有ファルコンチューブのペアを挿入します。
10. 20分間の精子を凍結。ドライアイス上で：ドライアイスは、微粉末状ではなく、ペレットにする必要があります。チューブは、十分に深くだけ彼らのキャップが（図1.6）を示すことがドライアイスに挿入する必要があります。ドライアイスでチューブを追跡するためには、1-20（キャップ​​に書かれた）から、ファルコンチューブの各ペアの数を与えると彼らはドライアイスに入る時間を記録する。
11. 液体窒素に会場のCRYOVIALS：。精子は20分間ドライアイスで凍結された後は、液体窒素含有デュワーフラスコに移す。精子は、液体窒素の冷凍庫に配置する時までここに保存されます。試料の温度が上昇しないように、液体窒素の風呂で冷凍ボックスに配置すること、場所のフリーザーボックス。デュワーフラスコからバイアルを回収し、cryoglovesで処理するための長い金属製のはさみを使用してください。冷凍庫ボックスは発泡スチロールの容器に液体窒素に浸漬保たれていれば別の方法として、cryovialsは冷凍庫のボックスにドライアイスから直接転送することができます。
12. 極低温の液体窒素の冷凍庫に保管してcryovialsは長期 。精子の生存能力を維持するために、それは、バイアルを液体窒素に浸漬保存されていることが重要です。我々の経験では、気相で保存されているバイアルは、時間の経過とともに生存能力を失う。
    速度が重要です！凍結保護剤を追加し、ドライアイス（すなわちステップ6-10）で、精子のバイアルを配置するまでの時間は最大30秒にする必要があります。
    

パートD：凍結保存精子を用いた体外受精の方法

我々は、これが二人で最良に動作することを見つける。他の人が精子を解凍しながら一人は女性から卵子を圧縮します。

1. 33℃に水浴を設定する
2. 雪解けへの準備ができるまで、液体窒素の冷凍庫と転送から液体窒素含有デュワーフラスコにクライオバイアル取り外します。
3. 35ミリメートルのプラスチックシャーレに女性から卵を絞り出します。可能であれば、卵の3クラッチを取得し、一皿に結合してみてください。あなたの最初のクラッチの1分以内に3つの良いクラッチを得ることができない場合は、（一つの良いクラッチが十分である）ステップ4に進みます。良いクラッチの定義：> 150均一に見栄えの良い卵（すなわち黄色、劣化の指標のない白い破片を持つ）。精子を融解している間覆われて皿にしてください。
4. 液体窒素からバイアルを取り外し、キャップを取り外します。 33 80から10秒° Cのウォーターバスにすぐに浸す。バイアル〜1 / 2の方法。
5. 素早く上下にピペッティングによりバイアルとのミックスを70μlを室温ハンクスを追加。すぐに卵に追加して、ピペットの先端で軽く混ぜる。
6. 遅滞なく、750μlの魚の水を加えて精子と卵子を活性化する。ミックスに渦巻く。室温で5分間インキュベートする。
7. 5分後、28で魚の水とインキュベート皿に料理を埋める℃に2-3時間後、数えると100ミリメートル料理（50/dish）に肥沃な胚を移す。受精の頻度を決定することができるように無精卵を数える。
8. 幼虫の世話をする！最初の5日間は、毎日水を変えると死亡胚を削除します。 5日目の保育園に膀胱を泳ぐいるだけ幼虫を置く。

パートE：代表結果

我々は2001年と2003年の間にティリングのために8600凍結精子サンプルのライブラリを作成するこのcrypreservationの方法論を使用。我々は、これらのサンプルの106を解凍し、その稔性を決定した。出生率は凍結精子で受精した卵の総数で割った値で体外受精で生産可能な胚の比率です。新鮮な（cryporeserved以外）精子一般的に> 95％の稔性がある、凍結保存した精子は、非常に低い出生率を持っている：29％（N = 106バイアル）の平均を。出生率のバイアルからバイアルの変動は1％未満から62％と高いに至るまで、大きいです。このばらつきは、図の標準偏差を表す大きなエラーバーで表されます。 2。しかし、これまでに融解106精子のサンプルで我々は一度だけ、両方の精子サンプルで0％の肥沃度を経験し、対応するティリングの突然変異の回復に失敗しました。

数年間のコース（2001-2008）を介して我々のライブラリから精子バイアルを融解することによって我々はこの方法で凍結精子のサンプルの平均出生率が残っていることを発見した（図2）時間の経過とともに安定した。 2001年に融解した凍結精子のサンプルの平均稔性は23.5％（11精子のサンプルに基づく）であり、2008年には25％（21精子のサンプルに基づく）であった。

他の研究者の数は今や彼らのラボでこの精子凍結プロトコルを使用しています。いくつかは我々が観察したものと同様の出生率とサンプル間の変動との良好な成功を報告している。その他の報告によれば、このプロトコルは、彼らの手で動作させるために失敗している。私たちは、問題のありそうな情報源があることを信じて：

1. ;時にドライアイスで冷却の異なる速度につながる、我々はプロトコルで推奨されている正確なcryovialsまたはコニカルチューブを使用するために失敗
2. 、次善の冷却速度につながる、粉末ドライアイスを使用して失敗
3. 貧しい肥沃でオスの魚を使用：単男性から精子の少なくとも1μlを取得する必要があります。それは100％の肥沃度近く得ることは非常に少ない新鮮な精子を取るために、また新鮮な精子で体外受精を行うことによって男性の生殖能力をテストすることができます、しかしこれは誤解を招く可能性があります。
4. 体外受精でのサブ標準的な品質の卵を使用した。決して完璧なクラッチを使用すると常に0％の肥沃度近くにも、実際に良い肥沃度を（重複バイアルの稔性に基づいて）持っている精子のサンプルからにつながります。

図1。精子凍結方法論の概略図。

図2凍結保存精子の受精能は、時間をかけて安定している。パーセントの肥沃度は凍結精子で受精した卵の総数で割った値で体外受精で生産可能な胚の数です。 "n"は、生殖能力に対応する年間でテストされて凍結保存した精子のバイアルの数を指します。エラーバーは標準偏差を表しています。各精子のバイアルは、別の男性からなので、バイアルからバイアルの変動が観察される。

ディスカッション

他の研究者の数は今や彼らのラボでこの精子凍結プロトコルを使用しています。いくつかは同じような肥沃度と我々が観察した同じサンプル間の変動を報告している。その他の報告によれば、このプロトコルは、彼らの手で動作させるために失敗している。私たちは、問題のありそうな情報源があることを信じて：

1. ;時にドライアイスで冷却の異なる速度につながる、我々はプロトコルで推奨されている正確なcryovialsまたはコニカルチューブを使用するために失敗
2. 、次善の冷却速度につながる、粉末ドライアイスを使用して失敗
3. 貧しい肥沃でオスの魚を使用：単男性から精子の少なくとも1μlを取得する必要があります。それは100％の肥沃度近く得ることは非常に少ない新鮮な精子を取るために、また新鮮な精子で体外受精を行うことによって男性の生殖能力をテストすることができます、しかしこれは誤解を招く可能性があります。大きく、より確実に色付きの男性は一般的に、より高品質の精子を与える。
4. 体外受精でのサブ標準的な品質の卵を使用した。決して完璧なクラッチを使用すると常に0％の肥沃度近くにも、実際に良い肥沃度を（重複バイアルの稔性に基づいて）持っている精子のサンプルからにつながります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μl disposable pipettes	Fisher Scientific	22-358697
Watch glasses	Pyrex	9985-75
2 ml cryogenic vials	Corning	430488
10 x 10 cryoboxes	Nalge Nunc international	03-337-7AA
15 ml conical tubes	Falcon BD	352099
Tongs	Fisher Scientific	10-316B
Cryofreezer	Taylor-Wharton	K-series	For example