蛍光その場でハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

要約

このビデオの記事では、良質の蛍光を達成するために精液のサンプルを処理する方法を順を追って、説明しますその場でハイブリダイゼーション。得られた製剤は、臨床診断のコンテキストで異数スクリーニングに用いることができる。

要約

Aneuploidiesは、ヒトで最も頻繁に染色体異常です。これらの異常のほとんどは、両親のgametogenic過程で減数分裂のエラーに起因する。人間の男性では、これらのエラーは、子孫にこれらの異常を送信するリスクの増加を表す数値染色体異常を持つ精子の生産につながることができます。

このような理由から、精子の核のin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光の技法は、広く臨床診断のコンテキストに組み込まプロトコルになっています。この練習では、遺伝的生殖アドバイスを求める患者の配偶子の数値染色体異常の頻度の推定値を提供します。

日付に、最も頻繁に精子のFISH分析に含まれる染色体は染色体X、Y、13、18および21です。

このビデオの記事は、順を追って説明し、人間の精液のサンプルを処理し、解決する方法、精子のクロマチンをdecondenseと変性する方法、どのように精子FISHの準備を取得するために進むために、そして顕微鏡での結果を可視化する方法。最も関連性の高い手順の特記事項は、最高の結果を達成するために与えられている。

プロトコル

I.サンプルの処理および細胞の固定

1. 液状化するまで、室温で20分間滅菌した容器に精液のサンプルのままにしておきます。
2. 遠心チューブに試料を移し、5分間千グラムで、それを回転させる。
3. 静かにパスツールピペットを用いて上清を除去して捨てる。
4. 10mlの最終容量を得るためにボルテックスで混合しながら、低張液（塩化カリウム、0.075M）37予備加熱° C、滴ずつ、追加してください。
5. 37水浴中にチューブを置きます℃で30分間。
6. 5分間千グラム間遠心する。慎重にペレットを乱すことなく、デカンテーションで上澄み液を捨てる。
7. 8ミリリットルの最終的な音量を得るためにボルテックスで混合しながら滴ずつ：ペレットを再懸濁させた後、作りたてのカルノア固定液（酢酸3時01メタノールの）追加。
8. ホワイトペレットを得るために必要な回数だけポイント6と7を繰り返します。
9. 作りたてのメタノール追加：酢酸（3:1）（小さなペレットとそのような場合で広がり良好な細胞を得るために必要な細胞濃度に最終的な音量を調整するために滴ずつを、数滴は高い金額でのサンプルに対し、十分になります回収した精子から、最後のボリュームは）1-2 mlを達することができる。テストスライドは、油を塗っていないスライドに再懸濁したサンプルを滴下し、位相差顕微鏡下でそれを調べることによって行うことができます。これは、得られた細胞の分散をチェックし、必要に応じて、さらにスライドで、、それを訂正できるようになるようになる。
10. 拡張子を、40cmの高さの最小値からドロップunfrostedのスライドの中央に細胞懸濁液の二、三滴（以前に、それらを脱脂するために-20℃でメタノールに保存されている）。を作るためにプロトコル全体にサンプルの場所を有効にするには、ダイヤモンドの鉛筆を使ってスライドの反対側の精子の拡張子を含む領域をマーク。
11. 少なくとも24時間、-20 ° Cでスライドを保存する。
    注意：メタノールの添加：酢酸（3:1）滴ずつ混合が精子凝集体の形成を避けるために非常に重要なステップですが。

II。脱凝縮

1. スライドは、-20℃で保存は、（室温でそれらを残す）プロトコルを続行するために解凍する必要があります。
2. 3分ごとに2倍の生理食塩水、クエン酸ナトリウム溶液（2xSSC）の2つの連続した​​コプリンジャーにスライドを配置。
3. 各コプリンジャーで2分間エタノール洗浄の一連のスライドを転送する。 70％エタノールで開始、100％で90％、仕上げによって従ってください。室温でそれを残してスライドを乾燥させます。
4. 37℃でジチオスレイトール溶液中でスライド（1,4 - ジチオスレイトール5mmの1％トリトンX - 100、2 - アミノ-2 - （ヒドロキシメチル）-1,3 - プロパンジオール50mmのを）インキュベートしますインキュベーターでCは、クロマチンをdecondenseする。この製品は、精子核のプロタミンのジスルフィド架橋そのコイルDNAを破壊することによって動作します。精子核のDNAは高度に圧縮されるので、これは非常に重要なステップです。ジチオスレイトール溶液（DTT）のスライドのインキュベーション時間は、この製品に対するサンプルの反応性に応じて調整する必要があります。それは2〜15分ごとに異なる​​ことができますが、通常、この時間は、8分程度です。
5. すぐに、各コプリンで3分間2xSSC二つの連続した​​コプリンジャーにスライドを転送する。
6. 各コプリンジャー（70％、90％および100％エタノール）で2分間エタノール洗浄の一連のスライドを配置することによって継続する。スライドを室温で乾燥させて。
   注：あまりにも短い露光には、いくつかのシグナルの欠如につながるだろう、一方DTTに過度の暴露は、手順の最後にFISHシグナルを分散させるという結果に。

III。交配

1. 73行でホルムアミド溶液（70％Formamide/2xSSC）℃で5分間でコプリンジャーにスライドをインキュベートすることにより、精子のDNAを変性させる。
2. コプリンジャー当たり1分（70％エタノールで85％を開始し、100％で終了）のためにエタノール溶液を介してスライドを転送する。室温で乾燥させるスライドにしておきます。
3. の直接5リットルを追加し、対応するすぐに使用できる15x15カバースリップ（AneuVysionアッセイマルチカラープローブパネル：CEP 18/X/YまたはLSI 21分の13）にプローブの混合物を。
4. それはビデオに示されているように、慎重に標的領域とプローブの混合物をまとめるためにカバースリップの上にスライドを配置。ラバーセメントでそれを封印。
5. 予め温めておいた37にスライドを配置° Cハイブリダイゼーションチャンバー（HYBrite™）および6〜24時間37℃で反応させる。
   注：精子のサンプルの変性が必須であるのに対し、プローブを変性の必要性は、製造業者によって決定されます。このプロトコルで使用されるプローブの混合物は、使用する準備ができていると、このケースでは、プローブの変性は不要です。
   プローブの混合物の体積は、ハイブリダイズした領域のサイズに応じて異なります。

IV。洗浄ポストハイブリダイゼーション

1. ハイブリダイゼーションチャンバーからスライドを取り出してください。
2. ラバーセメントを取り外し、慎重に側に静かにスライドカバースリップを引き出します。
3. 排除する非特異的ハイブリダイゼーションシグナルは、NP - 40は73で予め温めておいた0.4xSSC/0.3％でコプリンジャーに2分間、スライドを配置℃の水浴でC。
4. 2xSSC/0.1％のNP - 40 1分間室温で洗浄溶液にスライドを移し。スライドを室温で乾燥させて。
5. ターゲット領域（18 × 18カバースリップ用8リットル）に対比製品を追加。使用される最も一般的な製品は、4'、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI、バイシス社）です。
6. それはビデオに示されているように、カバーガラス（カバーガラスをマニキュアで密封することができるハイブリダイゼーションを維持するために）とハイブリダイズした領域をカバーする。
7. 彼らの見通しの分析まで暗所で-20℃でハイブリダイズしたスライドを保存する。これらの条件下でのスライドは、蛍光シグナルの強度を大幅に失われることなく、12ヶ月間まで保存できます。
   注：反対は、非特異的プローブのハイブリダイゼーションを洗い流すだろうに対し、より高い温度または過度の洗浄時間は、いくつかの信号の除去をもたらすことができる。
   追加された対比製品の体積がカバーするハイブリダイゼーション領域のサイズに応じて異なります。

V.の可視化

準備はDAPI /テキサスレッド/ FITCとシングルバンドアクア、FITCおよびテキサスレッドのためのフィルタのためのトリプルバンドフィルターを備えた蛍光顕微鏡下で評価することができます。標準の評価基準は、精子の核¹の正しい評価のために従う必要があります。

染色体X、Y、18用のプローブとハイブリダイズする準備は、これら3つの染色体のための信号が表示されます。すべての正常な精子一青の信号（18番染色体に相当する）、そして緑の信号（X -ベアリングの精子）や赤の信号（Y -ベアリング精子を）示す必要があります。

染色体13および21、13番染色体と21番染色体は赤色信号のための緑の信号のためのプローブとハイブリダイズする準備のためにすべての通常の精子に区別されなければなりません。

ディスカッション

このプロトコルは、精子のFISHの準備を取得するために人間の精液のサンプルを処理する方法について説明します。それがこのプロトコルを使用すると、雄の配偶子の染色体異常を分析することが可能です。精子異数性のスクリーニングは、基礎研究の文脈でと不妊男性に与えられた生殖アドバイスのいずれかのアプリケーションを持っています。臨床診断に最も広く研究されている染色体は...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Material	Roche Group	10197777001
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol	Material	Roche Group	10708976001
Acetic acid	Material	Merck & Co., Inc.	100.063
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit 20xSaline-Sodium Citrate 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI II) CEP 18/X/Y DNA probe NP-40 LSI 13/21 DNA probe	Material	Vysis Inc.	32-161075 30-805850 30-804941 30-171077 30-804820 30-171078
Centrifuge 5804R	Tool	Eppendorf
Centrifuge tube	Material	Nalge Nunc international	347856
Coplin jar (glass)	Material	Barloworld Scientific	Hellendahl (ZCT278)
Coplin jar (plastic)	Material	Deltalab	191087
Cover slips (15x15)	Material	Knittel Glaser	4600115
Cover slips (18x18)	Material	Knittel Glaser	4600118
Diamond pencil	Material	Hammacher	335117010
Ethanol	Material	Merck & Co., Inc.	100.983
Formamide	Material	Roche Group	11814320001
Freezer	Tool	Zanussi
Gloves	Material	Sanyo	101/3300
HYBrite™	Tool	Vysis Inc.
Immersion Oil	Material	Olympus Corporation	35505
Incubator	Tool	Heraeus Instruments
Methanol	Material	Merck & Co., Inc.	106.009
Micropipette	Material	Labsystems	Finnpipette (4500000)
Micropipette replacement tip	Material	Daslab	16-2001
Nail varnish	Material	Quo-cosmetics
Olympus BX60 epifluorescence microscope	Tool	Olympus Corporation		Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red.
Pasteur Pipette	Material	Rubilabor	211.0230
Phase contrast microscope	Tool	Nikon Instruments
Plastic pipette (3ml)	Material	Deltalab	200007
Potassium chloride (KCl)	Material	Fluka	60128
Rubber cement	Material	Best-test
Slides	Material	Knittel Glaser	4520022
Slide Saver Boxes	Material	Deltalab	19276.1
Sterile container	Material	Deltalab	409726
Syringe	Material	PentaFerte	002022300
Thermometer	Material	Comark Instruments, Inc	KM12
Tri-distilled water	Material
Triton X-100	Material	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tweezers	Material	B. Braun Medical	Aesculap (BD224R)
Vertical laminar flow hood	Tool	Burdinola	OR-ST 1500
Vortex mixer	Tool	Fisher Scientific	FB15012
Water bath	Tool	Raypa®