B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス

要約

このビデオでは、我々は、CD40 -活性化と免疫の誘導を研究するためにモデル抗原提示細胞（APC）として使用することができますC57BL / 6マウスの脾臓細胞からマウスB細胞、の拡張の手順を示しています。

要約

B細胞の研究は、CD40の活性化が、その抗原提示能を改善することが示されています。インターロイキン-4およびCD40リガンド（CD40L）で刺激したとき、ヒトB細胞は、高純度のCD40 - B細胞の非常に大きな金額に14日以内に末梢血の少量から困難なく拡張することができます（> 10

プロトコル

脾細胞からマウスCD40活性化B細胞（mCD40B）を生成するためのプロトコルは2つの部分に分かれています：パート板として使用されるマウスCD40リガンド（CD40L）を発現するHeLa細胞（tmuCD40L HeLa細胞）の調製を示していますフィーダー細胞に結合した。パートBは、実際のマウスCD40 - Bの文化を説明します。

フィーダー細胞のA.準備（tmuCD40L HeLa細胞）

tmuCD40L HeLa細胞は完全にコンフルエントになることはありません接着ヒト上皮細胞株、です。細胞は、そのため1週間に2回分かれています。以上の6週間以上の培養が推奨されていません。

1. 滅菌ピペットを用いて初代培養から古い培地を除去し、1 × PBS 10 mLで細胞を洗浄。洗浄後PBSを吸引除去する。
2. 37℃で10-15分では75 cm ^2のフラスコに1 ×トリプシン/ EDTAの4 mLを加え℃に細胞を分離するために穏やかなタッピングを使用してください。
3. 野生型の培地10mLを追加し、トリプシンで消化を停止するように静かに回転さ。
4. 滅菌ピペットで50mLのチューブに細胞懸濁液を移し、7分間265 xgで細胞をスピンダウン。
5. 上清を除去し、野生型の培地10mlに細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液のアリコートの細....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

このプロトコルの変更も、マウスCD40活性化B細胞の効率的な世代に降伏、特にCD40刺激し、使用されるマウス系統のタイプの起源について、可能な限りされています。アフマディら。 CD40 -リガンドマウスでトランスフェクションしたマウス線維芽細胞に対して同様の結果が示されている。このコンテキストでは外来の抗原の提示を確実に除外されますが、in vivoでのセキュリティと毒性?.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
フィーダー細胞の野生型媒体	フィーダー細胞を選択培地
試薬	濃度	試薬	濃度
RPMI 1640		RPMI 1640
L -グルタミン	300μg/ mLの	L -グルタミン	300μg/ mLの
FBS	10パーセント	FBS	10パーセント
HEPES	10 mMの	HEPES	10 mMの
ゲンタマイシン	15μg/ mLの	ゲンタマイシン	15μg/ mLの
		ハイグロマイシンB	は0.2 mg / mLの

mCD40 - Bの洗浄媒体	mCD40 - B培地
試薬	濃度	試薬	濃度
D - MEM		D - MEM
L -グルタミン	580μg/ mLの	L -グルタミン	580μg/ mLの
グルコース	4.5 mg / mLの	グルコース	4.5 mg / mLの
HEPES	10 mMの	HEPES	10 mMの
ゲンタマイシン	15μg/ mLの	ゲンタマイシン	15μg/ mLの
		MEM	0.1mmの（1X）
		FBS	10パーセント

試薬	会社	オーダーNo
RPMI 1640	インビトロジェンギブコ	REF 21875
D - MEM	インビトロジェンギブコ	REF 41965
Dulbeccos PBS（10倍）	PAA	猫なしH15 - 011
Gencin	デルタの選択	アートなし7395800
FBS	ロンザ	猫なしDE14 - 802C
HEPESバッファー	PAA	猫なしS11 - 001
MEM NEAA	インビトロジェンギブコ	REF 11140
ハイグロマイシンB	PAA	猫なしP02 - 015
組換えマウスインターロイキン-4	Immunotools	猫なし12340045
シクロスポリン	ノバルティス	猫なしNDC 0078-0109-01
トリプシン/ EDTA（10倍）	インビトロジェンギブコ	REF 15400-054

試薬	会社	オーダーNo
滅菌ピペットチップ	ザルスタット
6ウェルプレート	NUNC	猫なし140675
50mLのコニカルチューブ	BDファルコン™	猫なし352070
組織培養フラスコ	ザルスタット	猫なし83.1813.002