DNAベースの魚種の識別プロトコル

要約

この出版物は、DNAを抽出し、PCRとRFLP解析を行うことにより、魚の種を識別するために、アジレントの魚種の識別システムを使用する方法について説明します。

要約

我々は、高速、シンプル、かつ正確なDNAベースの新鮮な、加工魚介類の試料中に存在する魚種を同定するためのスクリーニング手法を開発した。この多目的な方法では、Agilent 2100バイオアナライザで解決し、RFLPのパターンマッチングソフトウェアを使用して、正しい種に一致させることができますフラグメントパターンを生成する制限酵素断片長多型（RFLP）分析に続いての魚試料から抽出したゲノムDNAのPCR増幅を採用しています。

魚の同定方法は、魚のサンプルからDNAを単離するための簡単​​な、信頼性の高い、スピンカラムベースのプロトコルを使用しています。サンプルは、溶液中に核酸を放出するプロテイナーゼKで処理されています。 DNAを結合バッファーでサンプルを懸濁し、シリカベースの光ファイバのマトリックスを含むマイクロスピンカップの上にロードすることによって分離されています。ファイバーマトリックスにサンプルバインドで核酸。固定化核酸は、汚染物質を除去するために洗浄され、全DNAを100μlの最終容量で回収される。単離されたDNAは、すべての魚のゲノムに見られる配列に結合する提供プライマーによるPCR増幅のための準備ができています。 PCR産物は、3つの種類の制限酵素で消化し、Agilent 2100バイオアナライザで解決されます。消化の反応で生産された断片の長さは、商業的に関連魚種から実験的に誘導されたRFLPパターンのデータベースを含むソフトウェアに一致するRFLPパターンを使用して、DNAのサンプルが準備された魚の種を決定するために使用することができます。

プロトコル

1：DNA抽出のために魚のサンプルを準備します。

1. テストする各魚サンプルの場合は、シングルを1.5 mlマイクロ遠心チューブに入れ、10 mgのおよび1g（rawまたはcooked）との間で体重、魚の組織片を置く。サンプルサイズに基づいて、生の魚のサンプルの重量を推定するためのガイドラインとして以下の図を使用してください。
   
   
   図1。魚試料の質量の推定値はサンプルサイズに基づく。
   
   
2. 65〜プレ暖かいプロテイナーゼK消化バッファー℃のインキュベーターまたはウォーターバスで5分間。
3. プロテイナーゼK消化バッファーおよびサンプルあたりのプロテイナーゼKを20μlの200μlを組み合わせることにより、プロテイナーゼKのワーキング溶液を調製。
   注：各使用前にプロテイナーゼKの新たなワーキング溶液を調製。
4. 魚の標本のそれぞれを1.5 mlチューブにProteinase Kを作業液の220μlを加え。 65チューブをインキュベート℃のインキュベーターまたはウォーターバス中で10分間。
5. ペレットあらゆる未消化の組織にXGの14,000 3 5分間微量遠心機でチューブをスピン。
6. 転送、新しい1.5 mlチューブに各上清の150μlのは。 チューブまたはチューブの上部に存在するかもしれない油状物の底部から任意の未消化物質を転送することは避けてください。上澄みのこれらの管は、ゲノムからのサンプルですDNAが抽出されます。

2：ゲノムDNAを抽出

1. 滅菌容器（ポリプロピレンチューブやガラスの瓶）で、90％のスルホランおよびサンプルあたりの核酸結合バッファー170μlの320μlのを組み合わせることにより、スルホランと核酸結合バッファーのワーキング溶液を調製。
   あなたは次の4週間以内に検査する予定な限り多くのサンプルを処理するために、この混合物の十分な量を準備することができます。この混合物を室温で30日間まで保存することができます。貯蔵中に光に混合物を放置しないでください。
2. それぞれの魚のサンプルにスルホラン/結合バッファーの混合物（上記のステップ1で調製した）の490μlを添加する。ボルテックスまたはピペッティング均質化するまで繰り返しサンプル。この混合物の添加は、640μlに各サンプルの合計量をもたらすでしょう。
3. 2 mLの容器のチューブ内に装着されているDNA結合スピンカップに各サンプルを転送（提供）とスピンカップの上部にチューブのキャップをはめ込みます。
4. スピンカップのマトリックスにDNAをロードするために14,000 xgで1分間遠にサンプルをスピン。
5. 削除し、 保持するスピンカップを 、ろ液を捨てる。各サンプルについて、レセプタクルのチューブにスピンカップを交換し、1 ×高ソルト洗浄バッファー500μlを追加し、チューブをキャップ。
6. 1分間、14,000 × gで遠心でサンプルをスピン。
7. 削除し、 保持するスピンカップを 、ろ液を捨てる。各サンプルについて、レセプタクルのチューブにスピンカップを交換、その後80％エタノール500μlを加え、チューブをキャップ。
8. 1分間、14,000 × gで遠心でサンプルをスピン。
9. 80％エタノールを500μlで3回洗浄の合計に対して、手順7と8をさらに2回繰り返します。
10. 80％エタノールの第三洗浄した後、削除して、 スピンカップを保持し、濾液を捨てる。そのレセプタクルチューブのスピンカップを交換して、繊維充填材を乾かすために14,000 xgで2分間遠にスピン。
11. 1.5 - M1のコレクションチューブにスピンカップを転送します。直接カップ内部の繊維の行列で、各スピンカップへのElution Buffer 100μlを追加します。スピンカップにコレクションチューブのキャップをパチンと室温で1分間インキュベートする。
12. 1分間の最大速度での遠心でサンプルをスピン。
13. 精製したDNAはマイクロ遠心チューブに溶出バッファーになります。スピンカップを捨て、チューブをキャップ。 DNAは、最長1ヶ月間4℃で保存することができます。長期保存の場合は、° Cまたは80℃20℃DNAを保存する
14. 必要に応じて、分光光度計でDNAサンプルの濃度を測定してもよい。

ゲノムDNA抽出プロトコルは、通常、5〜ng /μlに500 ng /μLの範囲の濃度のサンプルを得られます。 PCR - RFLPプロトコルは2000 ng /μLの0.05 ng /μLのからどこまでのDNAサンプルをウェルの中に動作します。

3：PCRの反応セットアップ

1. 滅菌、DNaseフリー水32μlでDNAの株式の8μlを組み合わせることにより、陽性対照のサケのDNAを50 ng /μlに希釈して準備する。ミックスする渦。
   希釈されたサンプルは、℃で将来の使用のために4℃で保存することができる。
2. 順番で、次の表にコンポーネントを組み合わせることによって反応を準備する。に記載されているボリュームをスケールアップすることによって同時に実行されるすべてのPCR反応のための単一の試薬の混合物を準備するテーブル。テストのDNAサンプルに加えて、ポジティブコントロールの反応と非テンプレートコントロールの反応が含まれています。各テストのDNAサンプルの準備、重複PCR反応をお勧めします。すべてのあなたの反応に加えて一つの反応容積の過剰のために十分な試薬の混合物を準備します。
   あなたが5テストDNAサンプルを持っている場合例えば、8の反応 （5試験の反応、1陽性コントロール、1なしテンプレートのコントロール、および1過剰）や、テストの反応の重複を含めている場合は13反応のどちらかのために十分な試薬の混 ​​合物を準備（10重複しているテストの反応は、1陽性コントロール、1ノーテンプレートコントロールと1超過）。
   PCRの試薬 ​​混合物

   コンポーネント	第1巻反応	ボリューム5反応
   のdH 2 O、滅菌	9μL	45μlの
   2 × PCRマスターミックス	12.5μL	62.5μL
   プライマーミックス	2.5μlの	12.5μL
   合計ボリューム	24μlの	120μlの

3. 渦は、試薬の混合物はよく、その後、個々の薄壁PCR反応チューブに24μlを配布する。
4. ポジティブコントロールの反応チューブに希釈陽性コントロールDNAを1μlを追加。テストのサンプルチューブに、テストのDNAサンプルを1μl加える。なしテンプレートのコントロール反応の場合は、DNAの代わりにDNaseフリー水を1μl加える。
   交差汚染を避けるために、各DNAサンプルのために新鮮なピペットチップを使用してください。サンプルを追加した後、すぐにチューブの内容物をピペッティングすることによって反応を混ぜる。
5. チューブを軽く混ぜ、遠心して反応管、渦管にキャップを。

4：PCRプロトコルを実行します。

1. サーマルサイクラーで反応を置き、以下に示すPCRプログラムを実行します。
   PCRサイクリングプロトコル

   セグメント	サイクル数	温度	期間
   1	1	95 ° C	5分
   2	40	95 ° C 50 ° C 72 ° C	30秒 30秒 30秒
   3	1	72 ° C	7分

5：ダイジェストPCR産物を制限酵素で

1. ラベル0.5 mlチューブまたは制限消化反応に使用される0.2 mlのストリップチューブ。 DdeI、HaeIIIとNlaIII：各PCR反応は、3つの異なる制限酵素で消化されます。したがって、それぞれのPCR反応のために、PCRサンプルの名前と制限酵素の名前で3つの別々のチューブにラベルを付けます。
2. 順番に以下のコンポーネントを組み合わせることによって、DdeI消化用試薬の混 ​​合物を準備します。各コンポーネントの倍数を使用して、すべてのDdeI消化反応（プラス少なくとも一つの反応容量の超過）のための単一の試薬 ​​の混 ​​合物を準備する。 PCRが完了すると、PCR反応は、制限断片長多型（RFLP）分析のための制限酵素で処理されています。
   DdeI消化試薬混合物

   コンポーネント	ボリューム
   のdH 2 O、滅菌	1.5μL
   10倍DdeIバッファ	0.5μL
   10倍DdeI酵素	0.5μL

3. 渦は、試薬の混合物はよく、その後DdeIのために標識された個々の反応チューブに2.5μLを配布する。
4. 順番に以下のコンポーネントを組み合わせることによって、HaeIII消化用試薬の混 ​​合物を準備します。各コンポーネントの倍数を使用して、すべてのHaeIII消化反応（プラス少なくとも一つの反応容量の超過）のための単一の試薬 ​​の混 ​​合物を準備する。
   HaeIII消化試薬混合物

   コンポーネント	ボリューム
   のdH 2 O、滅菌	1.5μL
   10倍HaeIIIバッファ	0.5μL
   10倍HaeIII酵素	0.5μL

5. 渦は、試薬の混合物はよく、その後HaeIIIのために標識された個々の反応チューブに2.5μLを配布する。
6. 用試薬液を調製する順番に以下のコンポーネントを組み合わせることにより、NlaIII消化は、 各コンポーネントの倍数を使用して、すべてのNlaIIIの消化反応（プラス少なくとも一つの反応容量の超過）のための単一の試薬 ​​液を調製する。
   NlaIII消化試薬混合物

   コンポーネント	ボリューム
   のdH 2 O、滅菌	1.5μL
   10倍NlaIIIバッファ	0.5μL
   10倍NlaIII酵素	0.5μL

7. 渦は、試薬の混合物はよく、その後NlaIIIのために標識された個々の反応チューブに2.5μLを配布する。
8. 各消化反応のために、標識されたチューブに適切なPCR産物を2.5μLを加える。テストPCR反応だけでなく、ポジティブコントロールの反応のすべては、すべての3つの制限酵素で消化する必要があります。
9. 渦消化反応して、チューブを軽く遠心する。
10. 37℃で2時間のすべての消化反応をインキュベートする。このインキュベーションは、サーマルサイクラーで行うことができます。必要に応じて、反応は37℃で一晩放置されることがあります。
11. ℃で15分間65に反応して転送する。このステップは、サーマルサイクラーで行うことができます。
12. 各ウェルの反応と渦に60mMのEDTA（キットに付属）を1μlを追加。

6：制限消化パターンを分析

1. ゲル色素ミックスを調製、チッププライミングステーションのDNAチップを配置し、DNAチップ上に混在して読み込む。
2. よくラダーシンボルとし、チップに12サンプルウェルの各々にマークへのDNAマーカーのピペットで5μlの。
   DNAマーカーは、緑に覆われたチューブでDNA千試薬キットで提供されています。
3. よく梯子のマークが付いているにDNAラダーのピペットで1μL。
   DNAラダーが黄色に覆われたチューブでDNA千試薬キットで提供されています。
4. DNAサンプルの各々に対して、下図のガイドラインに従ってチップ12サンプルウェルのいずれかに各制限酵素の反応のピペット1μL。このアプローチを使用して、井戸1-3ポジティブコントロールサンプル3消化反応のためである、井戸4-6試験試料1 3消化反応のためである、井戸7-9は、テストサンプル2 3消化反応のためです。と井戸10-12消化中に生成フラグメントの長さを決定するためにAgilent 2100バイオアナライザでの制限消化反応を3.Analyze試験試料3消化反応のためのものです。 AgilentのDNA千キットガイドはバイオアナライザでラボのチップを実行するための完全な命令を持っています。簡単なプロトコルは、ユーザーの便宜のために以下に提供されています。
   
   
   図2。チップ上に試料の組織。
   
   あなたは、未使用のウェルに4未満のDNAサンプル、水のピペット1μlを持っている場合。あなたが4 DNAサンプルが複数ある場合は、複数のチップを実行する必要があります。これは、すべてのチップ上で陽性コントロールのサンプルを実行する必要はないことに注意してください。
5. 2400 rpmで60秒間IKAボルテックスミキサーと渦のアダプターで水平にチップを置きます。
6. Agilent 2100バイオアナライザにチップを挿入し、チップの実行を開始します。入ってくる生の信号は、 インストゥルメントのコンテキストに表示されます。
   実行が完了したら、ピークはアルゴリズムを見つけるピークの設定を使用してすべてのサンプルのために識別されます。もしアルゴリズムが本物のピークを検出するために失敗したと思われる場合は、このアルゴリズムはピークを識別することができる値に高さのしきい値の設定値を下げる可能性があります。
7. アッセイのコンテキストに移動し、 チップ概要]タブを選択します。サンプルの[名前]フィールドに、以下の図に示すようにチップ上のすべての12ウェルのサンプル名を入力してください。
   
   
   図3。チップ概要]タブでサンプルのネームエントリー。

7：RFLP Matcherを使用して、テストサンプル種を特定する

AgilentのソフトウェアアプリケーションRFLPデコーダー消化反応で生成されたフラグメントの長さに基づいて、テストDNAサンプルの魚種を識別するために使用されることがあります。 表はポジティブコントロールの制限酵素期待される製品のサイズ（bp）を DdeI 117 7期待されるDNA断片のサイズ 、332、340 HaeIII 40、105、333 NlaIII 459の指示RFLP Matcherオブジェクトにデフォルトの解析設定を使用するここで提供される。ソフトウェアの操作とディスプレイの解釈の詳細については、ソフトウェアのヘルプシステムを参照してください。

1. RFLPデコーダプログラムを起動します。
2. ファイル>開く> XADファイル]をクリックします。
   [開く]ダイアログボックスのウィルlオープン。
3. 制限消化反応を含むDNAチップのためのXADファイルを選択します。 [開く]をクリックします。
   ダイアログボックスには、チップ上にロードされたサンプルの一覧を開きます。
4. つのDNAサンプルに対応する三つの消化反応を選択して、 酵素カラムの下のドロップダウンメニューを使用して、各サンプルに対して適切な制限酵素を指定します。下の図では、酵素カラムは、DNAサンプル1のために記入されています。
   
   
   図4。各サンプルのための制限酵素を指定する。
   
   
5. 下のマーカーの％として最小のピークの高さ"という名前のフィールドに、デフォルト値は10.0％です。必要に応じて、この値が失われた小さなピークを識別するために低下、または非固有のノイズに起因するピークを破棄するために発生する可能性のある電気泳動は。最小ピーク高さの値に調整を行った後は再統合をクリックします。
   
   
   図5。最小ピークの高さを割り当てる。
   
   
6. ダイアログボックスの下部のCalcをクリック。
   バイオアナライザの実行から得られた断片の長さのデータは、ソフトウェアの各フィールドに移入されます。
7. 画面の左上隅にスコアドロップダウンリストで、データの分析のための適切なアルゴリズムを選択します。分析中の魚のサンプルは、単一の魚種で構成されている場合、スコアのドロップダウンリストでサイコロ（NEIリチウム）を選択します。試料は、種の混合物から成る可能性がある場合は、 混合物を選択してください 。
   画面の下部の表は、 結合スコアが3つすべての消化反応の結果に基づいて最善の種に一致するをリストのラベル。種名だけでなく、共通名は、（下記参照）の表に記載されています。パーフェクトマッチは（1のスコアを持つもの）、緑色で強調表示されます。黄色で強調表示されたマッチは、マッチに近いと考えられている。あなたはその種のためのFishBaseウェブページを立ち上げるために種名をダブルクリックすることもできます。
   
   
   図6。種の同定は、消化に基づいています。
   
   
8. 画面上部の下側カットオフと一致公差のフィールドでは、最高の種の試合のスコアを向上させるためにデフォルト設定を調整することができる。 下限基準値がフィールドに指定された長さより短い任意のフラグメントを廃棄するために使用されます。 マッチの許容値は、フラグメントが一致したと見なされると予測フラグメントにする必要がありますどれだけ近い長さで決まります。
9. 繰り返しますが、これと同じチップ上に含まれていた残りのDNAサンプル用に4から8を繰り返します。

8：代表的な結果：

4種類の魚種から制限消化のサンプルをBioanlyzerゲルのイメージは下図のようになっています。正のDNAサンプルの期待される結果を下表に要約されている。


図7。制限消化反応サンプルのバイオアナライザゲルイメージ。各ゲルのレーンは、その反応で使用されている制限酵素で標識されている。

サーモンポジティブコントロールで予想されるDNA断片のサイズ

図8。サーモンポジティブコントロールで予想されるDNA断片のサイズ。

ディスカッション

我々は、魚介類製品の魚種の識別のための、シンプルで高速、かつ正確なDNAベースのスクリーニング方法を示しています。この強力な方法は、以下の複数の営業日で再現可能な、正確な結果を提供し、それが合理化されたプロトコルと簡単なセットアップのために商業テスト施設で実施することができる。それは実験的に誘導された魚種のプロファイルの拡張データベースとRFLPデコーダーソフトウェアを使用して分析される客観的なデータの生成によって特徴づけられる。

ルーチンの実装では、この試験方法は、水産物の偽装を防止し、政府の規制を遵守するのに適した正確な記録を維持するのに役立つ可能性を秘めています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer)	Agilent Technologies	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software	Agilent Technologies	G2953CA	G2950CA - desktop PC & Expert Software
Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504)	Agilent Technologies	5067-1504
Thermal Cycler	Various	Various
PCR Strip Tubes	Agilent Technologies	401428
PCR Strip Caps	Agilent Technologies	401425
96-Well Working Rack	Agilent Technologies	410094
Fish Species Identification System DNA Isolation Kit	Agilent Technologies	Contact
Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit	Agilent Technologies	Contact
RFLP Matcher Software	Agilent Technologies	Contact
100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent)	Various	Various
Sterile, nuclease-free water	Various	Various
Pipettors	Various	Various
Incubator or water bath set to 65°C	Various	Various
Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene)	Various	Various
round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes)	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various
Microcentrifuge	Various	Various
Microcentrifuge tubes 1.5ml	Various	Various
Tube rack 1.5ml	Various	Various
Pipette Tips	Various	Various