siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

要約

ここでは、画像への基本的なプロトコルを記述し、siRNAのトランスフェクション後のライブ哺乳類の組織培養細胞の有糸分裂のタイミングを定量化する。

要約

有糸分裂中に発生する細胞の組織と染色体ダイナミクスの変化をしっかりとゲノムと細胞内含有量の正確な継承を確実にするために調整されます。このような染色体の運動として有糸分裂の特徴的なイベントは、、容易に特定のGFPタグ融合タンパク質を発現する哺乳動物細胞株のタイムラプス蛍光顕微鏡を使用して、個々のセルごとに追跡することができます。 RNAiベースの枯渇と組み合わせることで、これは特定のタンパク質のレベルが低下した後に不具合が発生した有糸分裂の段階を特定するための強力な方法（複数可）することができます。このプロトコルでは、我々は有糸分裂のタイミングで潜在的な有糸分裂の調節タンパク質を破壊する効果を評価するための基本的な手法を提案する。細胞は、siRNAでトランスフェクトステージ上のインキュベーションチャンバー内に置き、そして自動化された蛍光顕微鏡を用いて画像化している。我々はどのように静止画のモンタージュや映画のどちらかを作るためにイメージシーケンスを処理するためにタイムラプス実験を、セットアップするためのソフトウェアを使用する方法について説明し、定量化し、発現する細胞ラインを用いて有糸分裂段階のタイミングを分析する方法mCherryをヒストンH2Bをタグ付け。最後に、我々は、タイムラプス実験を設計するための重要な考慮事項について説明します。この戦略は、他のアプローチを補完するものであり、薬物療法を用いて細胞周期を同期させることなく、有糸分裂の人口と2）の解析などの細胞を見たときに観察されていない可能性があります動態の変化に）の感度を1の利点を提供しています。このようなイメージング実験から視覚情報だけでなく、有糸分裂のサブステージを評価することができます、だけでなく、FACSによる細胞周期の解析から明らかではないと予想外の洞察を提供することができます。

プロトコル

siRNAのトランスフェクションと細胞調製

1. 使用される各ウェルにフィブロネクチン（10μg/mL）の0.5mLをを追加することで、4ウェルLabTek IIチャンバーカバーガラスを準備します。室温で10-15分間インキュベートします。
2. 製造業者の指示に従って、リバーストランスフェクションのためのsiRNA /リポフェクタミンRNAiMAX（Invitrogen社）の複合体を準備します。 （100μL合計）使用されるチャンバーあたり24ウェルディッシュの1つのウェルの推奨額を使用してください。 siRNAのトランスフェクションのための類似の製品/プロトコルを代用することができます。
3. チャンバーカバーガラスの井戸からフィブロネクチンを削除します。使用される各ウェルにsiRNAを/リポフェクタミンRNAiMAX複合体100μLを加える。
4. よくトランスフェクション混合物を含んでいるあたり注し2万ヒストンH2B - mCherry -発現細胞（500μLで）。
5. 細胞は、通常の細胞培養の培地1mLのトランスフェクション混合物を交換する前〜24時間インキュベートすることができます。
6. 画像取得の前に細胞をさらに24時間インキュベートする（48時間トランスフェクション後）。

顕微鏡のセットアップと画像取得

7. 画像取得の設定に以下の3つの主要部分があります：1）顕微鏡のステージに収まる、37の定数湿潤環境を維持する細胞インキュベーター° C、および5％CO _2、2）自動化されたステージを装備した倒立顕微鏡、自動化された蛍光と明視野シャッター、および自動化されたフィルタホイール、とステージ、シャッター、フィルターホイールを統合して制御する3）ソフトウェアパッケージ。私たちのイメージングセットアップでは、我々はLabTek IIチャンバーカバーガラスで使用できるOKOラボからカスタマイズしたセルにインキュベーターを使用してください。ステージ、シャッター、フィルターホイールは、Metamorphソフトウェアによって制御されていますヒント：OKOラボステージトップインキュベーターシステムが異なるプレート、皿、またはカバースリップの様々なサイズのためのアダプタも用意しています。
8. 、予め温めておいたと平衡化インキュベーターの蓋を開けるアダプタにチャンバーカバーガラスを置き、粘土で固定保持することによってインキュベーターでLabTek IIチャンバーカバーガラス位置。細胞培養の培地が乾燥しないように、チャンバーカバーガラスでカバーしておきます。蓋を閉じて、インキュベーターがその場でしっかりと保持されていることを確認し、顕微鏡のステージ上で全体のインキュベーターを置きます。
9. Metamorphを使用して、ソフトウェアのメニューバーで"アプリ/多次元取得"を選択して、実験を設定する。これは、場合（各色（複数の設定を行う場合）、数とステージの位置の場所のための露光時間は、タイムラプスの頻度と長さを選択できるウィンドウを立ち上げ、およびzのセクションの数になります希望する）。データファイルの保存先を選択ヒント：。Metamorph以外のソフトウェアを使用している場合、機能が多少異なる場合がありますが、全体的なコンセプトは同じです。 Micromanager、ほとんどのハードウェアのセットアップと互換性のあるオープンソースのImageJをベース集録ソフトウェアは、優れた代替手段です。
10. このプロトコルの目的のために、我々は、15段階の位置で8時間の2つの波長（明視野とmCherry）15分ごとで画像を取得しますヒント：より良い時間分解能が必要な場合は、その後、買収の時間間隔を短くすることができますが 。 、少ないステージの位置を使用することができ、より少ない有糸分裂細胞は、分析のために利用できるようになります。時間間隔を考慮フィルタセットを切り替えるためにフィルタホイールに必要な時間を取ることを検討する際には重要です。
11. 第一明視野照明を用いて細胞の分野に焦点を当て、それぞれの波長に最適な露光時間を決定します。ソフトウェアでは、唯一の明視野チャネル（これはそれぞれの買収の前に各段階の位置でオートフォーカスにソフトウェアを許可する）ためのオートフォーカス機能を調整するヒント：私たちは石油を必要とせずに優れた分解能を与えるために40倍乾燥した位相コントラストの目標を使用。他の目的は、所望の光学解像度に応じて使用することができます。
12. mCherryの波長に切り替えて、50ミリ秒の露出を使用してイメージをはめ込みます。良いイメージを表示するために必要な最小限に露光時間を調整します。それは、持続的な細胞の生存を確保するための露光量を制限することが不可欠です。原則として、これは最高の照明強度を増加させることによってではなく、NDフィルター（励起光の束を低減する）と長く、カメラの露光時間を使用することによって達成することができます。使用するのに、これ以外の波長に対して、この手順を繰り返しますヒント：テスト用の所定の露出で、長期的な細胞の生存を決定するには、一時的に割り当てられたタイムポイントの間隔を調整することによって所望のタイムラプス以上の細胞が生き残ることができる画像の総数をプレビューすることができます秒〜数分から（つまり、10分は10秒になります）。あなたの細胞は100〜200のエクスポージャー（または存続する場合適切な番号）、次にあなたの露出は結構です。されていない場合は、完全な実験をシミュレートするために励起光、露光時間、または画像の総数を減らすことができます。
13. 次に、選択して、細胞集団の適切なサンプリングを実現できるように、ステージの位置の適切な数をマーク。 Metamorphの位置を記録し、それぞれの取得のためにそこに返されますヒント：私は一般的に彼らはあまりにも密であることを非常に多くのたくさんの細胞が画像に存在する位置を探してみる、ではなく。また、有糸分裂を介して進行する多数の細胞を観察する良い機会を持つように十分なポジションを選択することが重要です。
14. すべてのタイムラプス、波長の露光時間、およびステージの位置情報が記録された後、ソフトウェアが適切に機器を制御しているかどうかを判断するために、画面上の"プレビュー"ボタンを選択します。
15. あなたが満足されれば、買収を開始する画面上の"取得"ボタンを選択します。その後、後ろに座るとコンピュータとの作業を行うために顕微鏡を許可するヒントは：。そのすべてが正常に機能していることを確認するために買収の少なくとも一つの完全なラウンドを通して自動化を守ってください。

画像処理と解析

16. 買収が完了したら、次のステップは、より扱いやすい形式に画像データを転送することです。このプロトコルの目的のために、私は、ImageJのプログラムを使用してイメージのモンタージュを生成する方法をし、Metamorphを使って動画を生成する方法を第一のデモンストレーションを行います。どちらの形式では、定量化のために有効になります。
17. 最初のステップは、データを確認することです。そのためには、メニューバーの"アプリ/レビュー多次元データ"を選択してください。あなたのファイルの場所を選択して、"View"を選択します。これは、個別に各ステージの位置から画像のスタックを見ることができるようになります。希望するステージの位置を選択し、"画像のロード"。あなたは、データフレームごとを通して進めることができるようになります。
18. 細胞が有糸分裂を通過するもののステージの位置（としてのDNAと細胞形態の両方によって決定される）については、Metamorphを使って映画やモンタージュを作る、またはそのようなImageJは（NIHを通じて無料で入手可能）などの他のプログラムとすることができます。
19. Metamorphの映画を制作するには、メニューバーの"プロセス/保存ムービー"を選択します。あなたは、どの使用するフレームは、速度、およびムービーのファイルタイプを選択することができます。その後、"ムービーの保存"を選択します。
20. モンタージュを作るために、私はこのようなImageJのような他のプログラムで使用することができます。STKファイルとして画像のスタックを保存します。
21. ImageJのでファイルを開き、有糸分裂を通過するセルが見つかるまで、フレームを進める。細胞の周りをトリミングし、"イメージ/重複"を選択ヒント：すべてのフレームを複製することを確認してください。
22. モンタージュを作成するには、"イメージ/スタックを/モンタージュを作成"を選択メニューバーで。ここには、モンタージュの大きさと形状を含むようにするフレームを指定することができ、フレーム間の境界を求めているかどうか。これらを選択し、"正常（Okay）"ヒット。 。。tifファイルとしてモンタージュを保存し、ImageJのまたはAdobe Photoshopのいずれかで、それ以降の処理を行うヒント：簡単に画像処理のために8ビットフォーマットにMetamorphで使用される16ビット形式からモンタージュファイルを変更します。
23. 有糸分裂の各段階で時間を計算するには、染色体が赤道（前期/前中期の時間）、フレームで整列されるまで、染色体が分離し始めるまでのt = 0（DNAの凝縮や細胞の丸めの最初の兆候）、フレーム数をカウント決定（中期の時間）、およびフレームの細胞が平坦化し始めるまで（後期/終期/細胞質分裂）。それぞれの有糸分裂の段階で計算された時間は、各フレーム間の時間間隔に依存します。

代表的な結果

図1は、ヒストンH2B - mCherryを発現するHeLa細胞株を使用する典型的なコントロールsiRNAのトランスフェクション実験の結果を示しています。この方法は、有糸分裂後期¹のタイミングでヌクレオポリンNup153のための予想外の役割を明らかに、有糸分裂のタイミングを定量化するために効果的に使用されています。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。

ディスカッション

イメージングと蛍光タンパク質技術の最近の進歩と、ライブイメージングは、細胞の解析²のルーチン課題となっています。 GFPの様々な（と他のカラーバリエーション^3）-タグタンパク質は、広く利用可能かを構築することが比較的容易であり、DNA /染色体ダイナミクス^4、5、中心体の複製^6、サイクリンBダイナミクスを含む細胞分裂の特徴の数を追跡するために使用することができます^7、核膜の破壊と再構築^8、9、有糸分裂紡錘体の形成^10、および細胞質分裂¹¹のさまざまな段階。蛍光標識の励起/発光スペクトルは互換性があるときにタグ付けされたタンパク質は、特定のイベント間の連携が評価できるように、単独でまたは組み合わせて使用​​することができる。大きく空間的および/または時間分解能は/必要な場合は、共焦点レーザー走査、回転するディスク、または共鳴スキャンを使用することができるかどうかを顕微鏡、とますます解像度で洗練された顕微鏡のオプションのリストは増え続けています。哺乳動物細胞における有糸分裂のライブイメージングは、ハイスループットRNAiと小分子の画面^12から14に使うために改変されています。従って、この技法を使用して1つの初期の実験は、比較的単純かもしれないが、この戦略の構築の可能性は広範囲です。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-075
Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	12-565-337	Additional chamber sizes are available
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Stage-top cell incubator	OKO Lab		Can use any appropriate chamber
Automated inverted fluorescence microscope	Olympus Corporation		Can use any appropriate microscope
Software package	Metamorph		Can use any appropriate software