ブラッドフォードプロテインアッセイの線形化

要約

迅速かつ便利なブラッドフォードアッセイによるタンパク質定量の精度と感度は本質的な非線形性によって危険にさらされます。我々は、大幅に精度を向上させる簡単な線形化法を示して10倍程度アッセイの感度が向上し、大幅な洗剤による干渉を低減します。

要約

ブラッドフォードクマシーブリリアントブルーアッセイにおけるタンパク質のマイクログラム量の決定は、590nmでの吸光度を測定することによって達成される。この最も一般的なアッセイは、生化学的測定値の正規化の目的のために、細胞ライセート、細胞の分画、または組換えタンパク質サンプルの迅速でシンプルなタンパク質の定量が可能になります。しかし、本質的な非線形性は、この方法の感度と精度が低下します。それは標準的なアッセイ条件下で、590 nmと450 nmの吸光度測定の比はタンパク質濃度と厳密に線形であることが示されている。このシンプルな手順では、精度を向上させ、ダウンウシ血清アルブミンの50ngの10倍、許可定量化に関するアッセイの感度を向上させます。さらに、一般的に細胞ライセートを作成するために使用される界面活性剤によって導入された干渉が大幅に新しいプロトコルによって低減されます。線形方程式は、質量作用に基づいて開発され、ベールの法則は完璧に実験データをフィット。

プロトコル

Bradfordタンパク質のキャリブレーションのグラフの線形化：

一般的にブラッドフォードアッセイ¹として知られているクマシーブリリアントブルータンパク質アッセイは、広くために迅速かつ便利なプロトコルだけでなく、その相対的な感度で使用されています。残念なことに、タンパク質濃度の広い範囲（図1）上の曲率の大きい程度がある。そのため、比較的高いタンパク質濃度の唯一の狭い範囲、20〜10 mg / mlのBSAは、次により良い線形回帰（図1、緑）に適合キャリブレーショングラフ、のために使用されます。しかし、非線形性が大きな誤差を避けるためにキャリブレーションのグラフの限られた範囲内に未知のサンプルのタンパク質濃度を必要とし、それも限られた範囲内で精度が低下します。非線形性は、タンパク質のマイクログラムの量が利用できない、特に深刻な問題を提示し、それは多くの場合、未知のサンプルの複数の希釈を必要とします。

オリジナルのブラッドフォードの論文で述べたように、"非線形性の源は、染料の2つの異なる色形のスペクトルに重なりがあるので。試薬自体にある^"1。実際には、クマシーブリリアントブルー色素の3つの形式は、アッセイ²の通常の酸性pHでの酸塩基平衡状態にある。赤、青、緑のフォームは、470でそれぞれ590と650nm、（図2）吸光度の最大値を持っている。青は激しく594 n....

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ディスカッション

ブラッドフォードタンパク質アッセイは、原因で、パフォーマンスと相対感度のその使いやすさに人気があります。プロトコルによって得られた距離、タンパク質全体の濃度以上の線形化は、未知のサンプルは、キャリブレーションのグラフの範囲内にする必要がないようにここでさらに、アッセイを簡素化発表。

重要なのは、改良されたプロトコルでは、さらにオリ?.......

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford reagent	Bio-Rad	500-0006
Bovine Serum Albumin	Amersco	0332
Multiplate absorbance reader	BioTek	Synergy2