接着および非接着性の哺乳動物細胞の in situ細胞下分画で

要約

顕微鏡のカバーグラス上に、哺乳動物細胞の in situ細胞下分画ではタンパク質の局在を可視化できる。

要約

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix.

Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

プロトコル

分別のためのI.準備

このセクションでは、ポリ- L -リジンコートした顕微鏡のカバーガラスと分画の前に細胞の添付ファイルの準備について説明します。必要に応じて細胞は一過性に付着前または後に、タンパク質の発現ベクターをトランスフェクトすることができます。

ポリ- L -リジンコートしたカバースリップのA.の準備

1. 蒸留水で1mg/mlポリ- L -リジンの溶液を調製します。
2. 22にロッキングプラットフォーム上で少なくとも1時間溶液中でそれらをインキュベートすることによりポリ- L -リジンでコーティングクリーンカバースリップ℃に
3. 二回滅菌蒸留水でコーティングされたカバーガラスを洗浄し、96％エタノールを持つ単一の洗浄に従ってください。
4. 空気はフィルター紙の上にコーティングされたカバーガラスを乾燥させ、将来の使用のためのドライコンテナ（一度乾燥、それらを積層することができます）に保管してください。

カバーガラスにB.添付細胞

非接着細胞（ここでは、K562細胞を使用）

1. 上向きにコーティングされた表面を有する6ウェルプレートのウェル中のポリ- L -リジンコートしたカバースリップを配置。
2. /よくダルベッコ変法イーグル10％ウシ胎児血清（FBS）を添加した培地（DMEM）、およびPS（ペニシリン100units/ml、ストレプトマイシン100mg/ml）の7 × 10 ⁵細胞の密度でシードK562細胞。 K562細胞の場合には一過性トランスフェクションは、細胞を播種する前に、エレクトロポレーション（250V /975μFでのメディアの200μlの中の1 × 10 ⁷細胞と0.4センチメートルエレクトロポレーションキュベット）を使用して実行することができます。
3. 37℃、5％のC CO ₂で24時間細胞をインキュベートする。
4. 培地を捨て、生理食塩水（PBS）バッファリングされた氷冷リン酸で細胞を2回洗浄する。
5. 細胞下分画プロトコルで従ってください。

接着細胞（ここでは、Cos - 7細胞を使用）

1. 6ウェルプレートのウェルにコーティングされていないカバースリップを配置。
2. PBSで2回洗浄は37℃で温した
3. 37℃でPBS中のトリプシン（0.03％EDTA、0.25％トリプシン）で消化して細胞を剥離℃で2〜5分間。細胞を過剰消化するために、主に個々の浮遊細胞が存在するとすぐに消化を停止しないことが重要です。
4. /ウェル、10％FBSとPSG（ペニシリン100単位/ ml、ストレプトマイシン100ug/mlとL -グルタミン292ug/ml）を添加したDMEMで6穴プレートに3 × 10 ⁵細胞の密度で細胞を播種による消化を停止する、通常のカバースリップ上で。接着細胞は、一般的に必要に応じしかし、ポリ- L -リジンコートしたカバースリップを使用することができる、通常の顕微鏡のカバースリップの上にも添付する。
5. 37℃、5％CO ₂で24時間細胞をインキュベートする。の場合Cos - 7細胞で一過性トランスフェクションは、トランスフェ6（Roche社）であれば、必要なと37℃でさらに24時間℃、5％のCO _2を回収するために左のセルを用いて行うことができる。
6. 培地を捨て、氷冷したPBSで細胞を2回洗浄する。
7. 細胞下分画プロトコルで従ってください。

II。細胞下分画

その場分数で回路図を図1に示すように、と変更以前に⁷と以下の詳細なプロトコールに記載してこれまで⁵に記載の方法に基づいているに応じて実行されます。それは、液体を除去する前にカバーを取り外し、各分画ステップの後、新鮮な6ウェルプレートにカバースリップを転送することをお勧めします。わずか4カバースリップが撮像が必要であるが、追加のカバースリップは、これは並列に実行する場合は、ウェスタンブロッティングのための全細胞抽出液と核マトリックスの分画を生成するために必要とされています。

1. 10mMのPIPES、300mmのスクロース、100mMの塩化ナトリウム、3mmののMgCl _2、1mMのEGTA：細胞骨格のバッファ（CSK）を準備し、フィルタ。 CSKバッファーは、新鮮な分別の日に準備する必要があります。
2. 必要な場合は、1つのカバースリップから細胞を穏やかに直接カバーガラスの上に200ulのTESバッファー（1％SDS、2mMのEDTA、20mMのトリス- HCl pH7.4）を配置し、1〜2分間インキュベートすることにより、ウェスタンブロッティングのために全細胞抽出液を調製するために使用することができます。 22℃全細胞抽出液を除去し、タンパク質は、1Mの250ul（NH ^4）2 SO ^4を添加^すると、他の西部のサンプルが準備が整うまで氷上でインキュベートすることにより、沈殿させることができる。
3. 22℃傾けて6ウェルプレートに2〜3回で二回1ミリリットルの氷冷PBSで残りのカバーグラスを洗ってください。
4. 細胞全体と新鮮な6 - ウェルプレートへの転送を表すカバーを取り外します。細胞の固定と免疫蛍光プロトコルに従ってください。
5. 静かに残りのウェルからPBSを取り除く。
6. + 0.1％（V / V）トリトンX - 100は、それぞれの残りのカバーグラス上に直接静かに200ulのCSKのバッファを配置することにより、細胞質と緩く保有核タンパク質を抽出し、上でインキュベートする1分間氷。
7. 細胞質を削除し、緩く、ステップ2で説明した核抽出液と沈殿物を開催しました。
8. 22で二回1ミリリットルの氷冷PBSでカバーグラスを洗う° Cを傾け6ウェルプレートで。
9. しっかりと開催された核物質を表すカバーを取り外して、細胞の固定と免疫蛍光プロトコルに従ってください。
10. 優しく+ 0.5％（V / V）トリトンX - 100は、残りの各カバースリップ上に直接優しく200ul CSKのバッファを配置することによって、しっかりと保持しタンパク質を抽出し、20分間氷上でインキュベート後、残りのウェルからPBSを取り除く。
11. しっかりと開催されたエキスを取り出して、ステップ2で説明したように沈殿する。
12. 22で二回1ミリリットルの氷冷PBSでカバーグラスを洗う° Cを傾け6ウェルプレートで。
13. クロマチン画分を表すカバーを取り外して、細胞の固定と免疫蛍光プロトコルに従ってください。
14. そっとして場所200ul CSKバッファー+ 100ug/ml DNase Iの30分の残りのカバーガラスとインキュベート上で37℃、残りのウェルからPBSを削除する
15. クロマチンエキスを削除し、手順2で説明したように沈殿する。
16. ° C傾け6ウェルプレート22に回氷冷PBSでカバーグラスを洗ってください。
17. 核マトリックス画分を表すカバーを取り外して、細胞の固定と免疫蛍光プロトコルに従ってください。
18. 必要に応じてマトリックスタンパク質は、ステップ2で説明したように200ulのTES緩衝液を用いてウェスタンブロットのための追加的な行列のカバースリップから削除することができます。
19. ウェスタンブロット用サンプルは4℃ベンチトップ遠心機で13000rpmで遠心分離されるべき℃、40ul SDSローディングバッファー（62.5mMトリス- HCl、pH6.8、2％SDS（w / v）の、50mMのDTT、中に再懸濁したペレットSDS - PAGEによる分析の前に10％グリセロール、0.01％ブロモフェノールブルー（W / V））。
    
    図1。回路図上皮細胞下分画での表現。細胞骨格のバッファ（CSK）は、10mMのPIPES、300mmのスクロース、100mMの塩化ナトリウム、3mmのMgCl _2を 、1mMのEGTAで構成されています。 TESバッファーは、1％SDS、2mMのEDTA、20mMのトリス- HCl pH7.4の構成されています。

III。細胞の固定と免疫蛍光

1. ゆっくりと30分間、4℃でそれぞれカバーしてインキュベート° Cに4％ホルムアルデヒド/ PBSを1mlを加える。
2. 各カバースリップ22のPBSを1mlと軽く2〜3回℃を洗う
3. 10分間22℃でそれぞれカバーしてインキュベートして、0.1％トリトンX-100/PBSの400ulを追加。
4. 各カバースリップ22のPBSを1mlと軽く2〜3回℃を洗う
5. 潜在的なバックグラウンド染色を低減するために20分間22℃で3％ウシ血清アルブミン（BSA）/ PBSとインキュベートの400ulを追加。
6. 各カバースリップ22のPBSを1mlと軽く2〜3回℃を洗う
7. 直接1時間22℃でカバースリップとインキュベート上にPBSで一次抗体の代わりに100ul。一次および二次抗体は、所望の濃度にPBSで希釈してください。これは、使用される各抗体のために最適化する必要があります。
8. 各カバースリップ22のPBSを1mlと軽く2〜3回℃を洗う
9. 22のPBSとインキュベートにおける二次抗体の代わりに200ul℃で1時間離れて軽いからC。
10. 各カバースリップ22のPBSを1mlと軽く2〜3回℃を洗う
11. DAPI（4',6 -ジアミジノ-2 - フェニル塩酸塩）を含むVectashieldマウンティング培地を用いてガラスの顕微鏡スライド上に各カバースリップを（細胞がダウンして）マウントする。
12. ペーパータオルを使用してカバースリップの周りから余分な封入剤をふき取り、少なくとも30分の光を避け、22℃でスライドをインキュベートする。
13. 透明なアクリルのマニキュアを使ってガラススライドにカバースリップを修正。
14. 蛍光顕微鏡による可視化する前に離れて光からスライドしてください。

IV。代表的な結果

図2。非トランスフェクトしたCOS - 7細胞の細胞下分画。分別したCos - 7細胞をホルムアルデヒドで固定し、DAPIを含む封入剤で処理しTRITCに共役/ C抗体α-チューブリン、α-ヒストンH1またはα-ラミンを使用して免疫染色を行った。画像は、10倍接眼レンズとライカ共焦点顕微鏡を使用して63x対物レンズで取得した。細胞核は、マーカー抗体で染色した同じ分野の細胞中にDAPIフィルターセットを用いて可視化したTRITCフィルターセットを用いて可視化した。

図3。 GFP - 6E2融合タンパク質は核マトリックスに関連付けられています。ヒトパピローマウイルス（HPV）タイプ6に融合された緑色蛍光タンパク質（GFP）で構成される融合タンパク質を発現しているCOS - 7細胞の細胞下分画E2タンパク質（GFP - 6E2）。トランスフェクトされた細胞におけるGFP - 6E2の局在は、GFP蛍光を経由して直接視覚化された一方細胞核はDAPI染色を介して可視化した。ラミンA / Cは、α-ラミンTRITCおよびTRITCフィルターセットに結合したA / C抗体を用いて可視化した。マージのイメージは、GFP - 6E2タンパク質の一部は核マトリックス（右下のパネル）に関連付けられていることを明らかにする。図2で説明したように画像が得られた。

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ディスカッション

一般的な問題や提案：

すべてまたは細胞のほとんどは、洗浄中に失われます。洗浄ステップ中に液体がカバースリップを避ける6ウェルプレートの側に徐々に追加する必要があります。同様に液体を慎重に傾けプレートによって除去されるべきであると徐々に余分な水分をオフにピペッティング。細胞接着は、ポリ- L -リジンコートしたカバースリップを使用して増やすこ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Chemical	Sigma-Aldrich	A9647-100G
DNase I	Chemical	Sigma-Aldrich	DN25-1G
poly-L-Lysine	Chemical	Sigma-Aldrich	P-8920
Trypsin	Chemical
EGTA	Chemical	Sigma-Aldrich	E4378-25G
Fomaldehyde	Chemical	VWR	284216N
PIPES	Chemical	Sigma-Aldrich	P-6757
Sucrose	Chemical	Fisher Scientific	S/8600/53
Triton X-100	Chemical	Sigma-Aldrich	T-6876
Mounting Medium with DAPI	Chemical	Vector Laboratories	H-1200
Fugene 6 Transfection Reagent	Chemical	Roche Group	11814443001
Histone H1	Antibodies	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-8030
Lamin A/C	Antibodies	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-20681
Tubulin-α	Antibodies	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-32293