ラット中大脳動脈の血管縫合閉塞による局所脳虚血モデル

要約

ラットにおける虚血性脳損傷の外科的誘導は、脳卒中の研究に広く使用されているモデルです。ここでは、中大脳動脈の閉塞による局所脳虚血の誘導を示す。組織染色および磁気共鳴イメージングによる結果梗塞の可視化も示されている。

要約

脳卒中は、身体障害^、1世界中の成人の死因の第3位の主要な原因です。人間のストロークでは、非常に可変臨床状態が存在し、局所的虚血の動物モデルの開発では、しかしながら、実験的に誘発梗塞体積の再現性を達成することが不可欠です。ラットは、その比較的低い畜産コストへと人間^2,3のように、その頭蓋循環の類似性に起因する脳卒中のための広く使用されている動物モデルである。ヒトでは、中大脳動脈（MCA）は、最も一般的に脳​​卒中症候群に影響されており、MCA閉塞（MCAO）の複数のメソッドは、動物モデルにおけるこの臨床的な症候群を模倣するために記載されている。再疎通が一般的に人間の急性脳卒中後に発生するため、閉塞の期間後の再灌流は、これらのモデルの多くに含まれています。このビデオでは、我々は、高血圧自然発症ラット（SHR）における一時的な血管縫合MCAOモデルを示しています。シリコンチップのコーティングされたフィラメントは、再灌流に続いて、60分間MCAの原点にintraluminally配置されます。最適な閉塞期間がそのようなウィスターまたはSprague - Dawley系など、他のラット系統、に大きく左右されますのでご注意ください。ラットにおける脳卒中のいくつかの行動の指標が示されている。局所的虚血は、2,3,5 - トリフェニル塩化（TTC）MCAOから24時間後に脳切片を染色することによってT2強調磁気共鳴画像を用いて確認されています。

プロトコル

MCAOラットモデル

術前準備

無菌操作は、すべての生存外科的処置に使用する必要があります。商業用消毒剤で外科作業面を消毒し、オートクレーブで滅菌手術器具のパック、ドレープ、ガーゼ、綿棒、縫合糸、およびメス刃を準備。手術用マスク、髪のボンネットと滅菌手袋を着用してください。 Germinator乾燥ビーズ滅菌器は、複数のラットの手術を1つのセッション中に行われる場合の手続きの間に手術器具をresterilizeするために使用されます。手術中のラットの低体温を防ぐために、吸収パッドの下に水ジャケット恒温毛布と場所をPrewarm。

1. 誘導室に場所高血圧自然発症ラット（または任意の他のラット系統）とイソフルラン5％麻酔を誘発する（麻酔マシンは1.0 L / minに設定する必要がありますO ₂と1.0 L / minのN ₂ O）。麻酔を維持するためにイソフルラン1〜2％まで下げてください。
2. 両眼に人工涙液軟膏を適用します。
3. バリカン（＃10ブレードとオスターA5）を使用して、将来の切開部位を超えて喉と左頸部の領域を剃る。
4. ガーゼのパッドにBetadineを適用し、外側に螺旋状に、外科領域の中心から始まる皮膚を消毒する。同様のパターンでパッドを動かし、70％エタノールを含有する滅菌ガーゼパッドですすいでください。 3サイクルの合計のための両方のステップを繰り返します。
5. 将来の切開部位に沿って皮下0.5％ブピバカイン0.2mLを注入する。
6. 滅菌外科用ドレープと滅菌メリヤスやカバーにラットを置きます。

MCAの一時的な閉塞

7. 手術用顕微鏡下で、腹側正中切開を行い、浅筋膜を切除している。
8. 、最後に胸鎖乳突筋と、顎二腹筋（簡単にその光沢のある白い腱の部分で識別される）、気管上正中線にある胸骨舌骨、：浅筋膜の下に、そこに三角形を形成し、左三筋に腺組織です。
9. 慎重に鋭いと鈍的切開は頚動脈（排他的鈍的切開が偶発的な組織の損傷を最小限に抑えるためにいくつかによって優先されることがあります）を識別するために、三角形の内部で実行されます。外部、内部、および総頸動脈（ECA、ICA、CCA）が公開されています。頸動脈は大きく、目に見えてパルスです。迷走神経は、両方に共通し、内頸動脈の外側面に沿って走ることと急激に一般的と内頸動脈から解剖されている見られている。
10. 二つのECAのブランチは、最初の分岐は、内側の見出しと第二の分岐が横方向に向かって、急激に解剖されています。両方のブランチには、大きな船を動員でより容易にするために可能になる、焼灼とカットされています。
11. ECAは、今より吻方解剖される。舌骨が発生する可能性があります、これは吻側節の切除範囲が制限されます。外頸動脈は6から0絹縫合糸で遠位方向に可能な限りオフ結びついています。
12. 別の6から0絹縫合糸は、ICAとの分岐の近くにECAの周囲に疎に配置されます。閉塞のために使用する管腔内縫合後の手順で、ここを通過するように血管を閉塞しないようにしてください。
13. 顕微クリップは、分岐の近くに、共通および内部頸動脈上に配置されています。
14. 最初の部分的な動脈切開は、外頸動脈に2つの絹縫合糸の関係の間に作成されます。
15. 顕微クリップが配置されているCCAに向かってECA内腔に、その丸みを帯びた、シリコンでコーティングされた先端からキンク2.0 Cmを、4から0モノフィラメントナイロン縫合糸2.2 -3.0 cmの長さをご紹介。これらの縫合糸は、（Doccol社、レッドランズ、カリフォルニア州、米国）市販されている。切り株と位置ECAとICAの分岐下切り株を解放するECA（部分的な動脈切開部位で）の残りの部分を切り取り、これをより簡単腔内縫合糸は、ICAにスライドできるようになります。
16. 腔内ナイロン縫合糸を固定し、出血を予防し、ICAからの微小血管クリップを削除するには、ECAの切り株の周りに絹の縫合糸を締めます。出血を確認するためにそれを削除する前に、ゆっくりとクリップを開きます。
17. 中大脳動脈（MCA）にECAからICA内腔にナイロン縫合糸を進め続ける。この長さは通常、18〜20ミリメートルで、挿入する前に、縫合糸のよじれを配置するための理由です。ナイロン縫合糸の可変長が挿入された後、抵抗を感じることがあります。これは多くの容器の外にまだ存在ナイロン縫合糸のでが発生した場合、それは、縫合糸は、おそらく（下記の注を参照）翼口蓋動脈に入っていることを示しています。と引いて、曲線縫合糸が少し内側に実行される、ICAに沿って継続する。また、PPAの起源の解剖は、より適切なパスを可視化するために行われることがあります腔内フィラメントの。抵抗が2センチメートルキンク位置し、後に感じられるまでナイロン縫合糸を挿入し続ける。この時点で、腔内縫合糸は、MCAの起源をブロックしています。 MCA閉塞は、レーザードップラー流量計を（一つの機器のソースの材料表を参照）を使用して局所脳血流量の減少を監視することにより確認することができます。また管腔内縫合糸でこの容器の偶発的な挿管を避けるために、好ましい場合ICAの翼口蓋動脈からの起源が直接、オフ結合できることに注意してください。
18. タイマーと記録閉塞の開始時間を開始します。
19. CCAからマイクロクリップを取り外します。
20. 3から0絹縫合糸（単純な連続パターンの再灌流のために再オープンするが促進される）とすぐに切開を（真皮、組織層carnosus、皮下組織の層）閉じて、慎重に回復ケージにラットを置きます。鼻と口の周りケージの床は、敷料と麻酔からのモニターの回復がないことを確認してください。

MCAの血流の回復（再潅流）

21. 閉塞期間が終了する直前に、ラットを再び麻酔Betadineと70％エタノール（3サイクル、前と同じように）に切開部位を消毒し、閉鎖縫合糸を除去して切開を再度開きます。
22. 以前と同様に、CCA上でマイクロクリップを置きます。
23. 縫合糸の端は、ICAを通して見えるようになるまでICAから遮蔽縫合の途中で撤退。 十分にICA / ECAから縫合糸を除去しないでください！
24. 腔内縫合糸の端の上にICAでマイクロクリップを置きます。
25. 完全に遮蔽縫合糸を除去し、しっかりとECAの切り株をオフにネクタイ。閉塞の記録の終了（再灌流の開始）時間。
26. ICAからマイクロクリップを取り外します。
27. CCAからマイクロクリップを取り外します。
28. 滅菌生理食塩水を数滴で地域を湿らせ、簡単な中断パターンを使用して3から0絹縫合糸で切開層（真皮、組織層carnosus、皮下組織）を閉じます。
29. 腹膜腔に（あなたの機関のガイドラインに従って、または他の適切な術後の鎮痛剤）0.05 mg / kgのブプレノルフィンを投与する。
30. 温めた生理食塩水腹腔内の5ccを注入する。これは、回復期の間に水和を提供します。
31. 麻酔からのラットの回復を監視します。
32. ラットが回復した後は、尾でラットを保持し、ラットの両側に回すことができるかどうかを観察することにより、心筋梗塞の行動を示すかどうかをテスト。片側にカールするだけ期待されている。単純なスコアリングスケールは、（説明を参照）初期のポスト梗塞behavorial機能を記録するために使用することができます。
33. ブプレノルフィン（上記と同じ用量）の追加の注射は痛みの軽減の24時間ごとに6〜8時間を与えられるべきである。動物は、不快感の兆しを見せている場合鎮痛を拡張。

代表的な結果

図1。血管縫合糸による中大脳動脈の閉塞。ラットの頭蓋循環系の概略図は、MCAの起源を閉塞シリコンコーティングされた管腔内縫合糸で示されています。左のECAのオフOAとSTの枝を結紮し、ECA遊説して回る縫合のネクタイは、場所の管腔内縫合糸を保持している。 ACA、前大脳動脈、BA、脳底動脈、CCA、総頸動脈、ECA、外頸動脈、ICA、内頸動脈、MCA、中大脳動脈、OA、後頭動脈、PCA、後大脳動脈、PComA、後交通動脈、PPA、翼口蓋動脈、ST、上甲状腺動脈。図は、佐々木ら ⁴と ​​リー³から適応。

図2。ラット脳24時間の冠状セクションの代表的な磁気共鳴イメージングは、1時間の過渡MCAO後。局所的虚血に伴う脳浮腫はT2強調MRI画像で可視化される。梗塞ゾーンは、T2画像で（明るい）高信号が表示されます。同様の梗塞のパターンは、拡散強調画像と見かけの拡散係数のマッピング⁵など、より高度なMRI技術を見ることができます。

図3。ラットの脳の代表的な冠状のセクションでは、1時間の過渡MCAO後のTTC 24時間で染色。TTC染色は図2に示したものと同じラットの大脳皮質と線条体の白色（未染色）梗塞領域を明らかにする。組織学的に決まる、最終的な梗塞領域は、T2病変よりわずかに小さいかもしれないが、焦点虚血性病変の一般的なパターンは、MRI T2強調画像に見られるものと同様であることに注意してください。

ディスカッション

脳虚血の齧歯類のモデルは、グローバルまたは焦点となどの可逆または不可逆的に分類することができます。私たちは、人間の脳卒中患者では、次の再疎通を発生する可能性が再灌流障害を模倣するために、可逆局所的虚血モデルを使用します。ラットの株式人間、ウィリスのサークルによる広範な頭蓋内側副血行路と一貫性のない梗塞ボリューム⁶の軟膜吻合の結果と同様に頭蓋循環の利点ながら。梗塞サイズ^7-10正常血圧ラットと比較して局所脳虚血にさらさSHRsに大きいので、我々は、高血圧自然発症ラット（SHR）株を使用してください。 SHRsのストローク誘導はまた、より一貫性があり、他の一般的に使用される菌株¹¹のよりも死亡率が生成されることがあります。変動が梗塞体積の変動に追加できるので、さらに、生理的パラメータは、手術中に監視する必要があります。これらのパラメータは、血圧、動脈のO ₂及び虚血性傷害^2,12を悪化させるCO ₂レベルは、低体温、および高血糖を、含まれています。それは神経虚血性損傷の程度を軽減する、そのため、手術中の体温調節加熱パッド上にラットを置くことが不可欠であることができるので、低体温症は、特に懸念される。

我々は、商業的に調製シリコンでコーティングされた梗塞サイズ^13-15一貫性を高めるための試みで、この手順で縫合糸を採用。伝統的に、MCAを閉塞するために使用する管腔内縫合糸は、火炎、丸め3から0ナイロン縫合糸の先端またはコートの小さな接着剤ビーズ¹⁶の縫合糸の先端をするためにホットグルーガンを使用することによって調製されている。これらの手順は、さまざまな先端径を持つ縫合糸を生産し、したがって、与えられたラットの血管の直径と一致する縫合糸を見つける前に閉塞におけるいくつかの試みが必要になる場合があります。このビデオで説明されているMCAO方法に関するその他のバリエーションは、担保の血流^6,9を減らすために純粋な皮質梗塞^17、およびMCAと同側の総頸動脈の同時閉塞を持っているために、レンズ核線条体枝を温存し、より遠位の閉塞を、含まれています。

脳卒中の機能的効果は、特定のタスクの赤字は、単純なスコアリングの規模に反映されている行動テスト、さまざまなを用いて評価することができる。例えば、Bederson ら ^18は、上昇体の位置、横方向のプッシュに非対称性、およびオープンフィールド旋回動作で前肢屈曲の程度に神経学的スコアのグレーディングラットを開発した。ラット上昇床に、両方の前肢を拡張し、対側前肢の屈曲を持つラットのみ"中程度の赤字（1）"と分類されたのに対し、他の赤字は、"（0）ノーマル"等級付けされなかった展示。 "重度の等級2"のラットは、横力に対側で減少した抵抗を表示し、"厳しい等級3"ラットは、さらに行動を一周に従事。低学年の行動障害は、常に次の上位グレードで観察（例えば、グレード2と3匹の動物にも前肢屈曲を表示）と、これらのスコアは、梗塞サイズ¹⁸の差の予測であった。従って、このような単純なスコアリングシステムは、脳卒中からの機能障害の迅速な、一貫性の半定量的評価が可能になります。

脳梗塞の程度の測定は、一般的TTC、クレシルバイオレット（ニッスル染色）またはヘマトキシリン​​とエオシンを用いて組織の損傷の組織学的染色によって達成されます。拡散強調閉塞後早期の時点で梗塞を視覚化するためにMRIを含む磁気共鳴イメージング技術は、組織を採取することなく、個々のラットにおける梗塞体積の測定を可能にする。イメージングMCAO後のラットが治療前の政権にすべての実験および対照動物は、ばらつきの交絡影響を軽減する、開始するために同じようなストロークを経験した研究者の自信を与え、これが脳卒中後の神経保護治療の有効性を決定することを目的とした研究では特に貴重です。ストローク誘導インチ

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture	Doccol Corporation		2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter
Spontaneously hypertensive rats	Charles River Laboratories		290-300 g, male
Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads	Gaymar Industries
Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit	Summit Hill Laboratories
Germinator 500 glass bead sterilizer	CellPoint Scientific
Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor	TSI Inc.