慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoでイメージング

要約

我々は繰り返しマウスミクログリアを可視化し、単球を循環させるための方法を説明します。 in vivoで経頭蓋二光子顕微鏡を用いて数時間、数日または数週間にわたって。我々は、HIV - 1調節タンパク質タットの隣接定位注入によって活性化することができる静止ミクログリアの断続的な観察を可能にする間伐 - 頭蓋骨のウィンドウを準備する方法を示します。

要約

伝統的に神経科学では、in vivoでマウス中枢神経系の二光子イメージングには、どちらのオープン頭蓋骨の^1,2または間引き頭蓋骨³製剤の使用に関与している。オープン頭蓋骨のテクニックは非常に汎用性ですが、それは侵襲的であるため、ミクログリアを研究するための最適ではありませんし、ミクログリアの活性化を引き起こす可能性があります。間伐-頭蓋骨のアプローチは、低侵襲であるにもかかわらず、繰り返し再間伐頭蓋骨の慢性的イメージングに必要な、組織の損傷とミクログリア活性化のリスクを増加させ、イメージングセッションの限られた数を可能にする。ここでは、2光子顕微鏡を使用して、長期間にわたってin vivoでのマウスのミクログリアを監視するための慢性的な薄頭蓋骨のウィンドウ法を提案する。私たちは、断続的な観察の三週間の経過とともに半透明のまま並列したガラスカバースリップで安定した、アクセス可能な、間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ（TSCW）を調製する方法を示しています。このTSCWの準備ははるかに免疫学的に不活性薄く開いて開頭術または反復頭蓋骨よりミクログリアの活性化に関してであり、数週間の期間中にイメージングセッションの任意の数を可能にします。我々は、軟膜表面下≤150μmまで増強緑色蛍光蛋白質とミクログリアを視覚化するCX ₃ CR ₁ GFP / +マウス⁴でTSCWを準備。我々はまた、この準備が耐久性のあるmicrogliosisを誘導できるTSCW、隣接するタットHIV - 1の神経毒性タンパク質、の定位脳の注射と組み合わせて使用​​することができることを示している。したがって、この方法では、HIV関連の神経認知障害（HAND）とneuroinflammatoryコンポーネントと他の神経変性疾患のモデルで生きている脳内の時間をかけてミクログリアの形態と運動性の変化を調べるために非常に便利です。

プロトコル

1。イメージングのために動物を準備

1. 我々の実験では、我々はミクログリアを含む単核細胞系譜、でGFPを発現すること成人CX ₃ CR ₁ GFP / +マウスを使用してください。マウスの^4つの異なる株が特定のプロジェクトのニーズを満たすために使用することができます。
2. 0.05 mg / kgのフェンタニル、5.0 mg / kgのミダゾラム、および0.5 mg / kgのメデトミジンからなる三薬剤のカクテルの腹腔内注射したマウスを麻酔。動物が、もはやそのような、痛み刺激に対する応答が返されなかった後TSCWは⁵手術の準備が始まるテールピンチとして。手術とイメージングを通して、我々は、ポスト麻酔の低体温症を防ぐために、加熱パッドで動物を保​​つ。必要に応じて、麻酔薬のカクテルの三分の一元用量のブースター投与量は、元の麻酔の平面を復元するために与えることができます。
3. 動物の瞬目反射を抑制する麻酔中の眼の潤いを保つために、保護眼軟膏、と動物の目を覆う。かみそり、鋏、はさみ、または化学的方法を用いた動物の頭皮から髪を削除します。 10パーセントポビドンヨード溶液および70％エタノールを使用して頭皮を消毒。すべての手術器具は、ガラスビーズ滅菌器、または70％エタノールで消毒と滅菌、オートクレーブする必要があります。
4. 頭蓋骨の尾4〜5ミリメ​​ートルを開始し、目の前に前方に進んで、小さなはさみを使って頭皮の正中切開を加えます。それは、この切開は十分な長さの皮膚は、2光子イメージング（図1）中にマウスの頭部を安定させるために使用されるヘッドの板の接着に干渉しないということが重要です。解剖範囲で薄くする領域を識別します。頭蓋骨は、これらの分野でも安定ではないと基盤となる大血管と髄膜のイメージングを妨害するため、直接、頭蓋縫合の上に配置関心のある分野を避けてください。
5. 頭蓋骨の上に膜を乾燥し、微細なピ​​ンセットやカミソリの刃を使用してすぐにそれをこすり取る際には、滅菌綿棒で塩化第二鉄の10％溶液に続いて100％エタノールを適用します。不安定なヘッドプレートアタッチメントで膜の結果を削除するには失敗。
6. ヘッドプレートの下に表示するウィンドウのエッジの周りPermabond 910接着剤の薄層を配置。光の圧力（図1）を持つ動物の頭蓋骨上に関心領域を介して接着剤でコーティングされたヘッドプレートを置きます。ヘッドプレートのみ頭蓋骨の骨に接着されていることが重要です。ヘッドプレートと頭蓋骨の間に挟まれているすべての皮膚や粘膜の結合の安定性が減少します。即座に注射器ボンド接着剤を使用して、表示​​ウィンドウの周囲にアクリル酸の少量を適用します。最後に、漏れを防ぐために、表示ウィンドウの端にロックタイト454の少量を適用する。
7. 動物のホルダー（図1）にヘッドプレートをネジ込み、軽くピンセットでプロービングによる郭清範囲の下でヘッドプレートの安定性を確認してください。ヘッドプレートの相対頭蓋骨のない動きはないはずです。漏れがないことを確認するために、表示ウィンドウに生理食塩水の低下を置きます。

2。間伐スカル皮質ウィンドウの準備

1. 頭蓋骨を薄くするための準備として、滅菌綿棒、圧縮空気の組み合わせを使用して、頭蓋骨を乾燥させる。我々は4000rpmで設定Microtorque IIのドリルの滅菌IRF 007ドリルビットを持ち、最初は薄い頭蓋骨。非常に穏やかに、頭蓋骨の2〜2.5ミリメートルの直径の円形領域を薄く始める。頭蓋骨のほぼ平行な光だけ大胆な動きを使用して、直接的な下方圧力を使用していない。圧縮空気を使用して骨のほこりを除去するごとに20〜30秒を掘削停止します。掘削中のこれらの改行は、基礎となる脳組織への熱による損傷がないように頭蓋骨を冷却することができます。
   1. 掘削が進むにつれて、湿り気海綿骨の層（すなわち"板間層"）への移行に注意してください。この層に達すると、ドリルで余分な注意を払う。
2. 時折薄くなった領域の上に生理食塩水を置き、解剖範囲で表示することによって、頭蓋骨の薄さを確認してください。生理食塩水は、さらに放熱が可能になります。頭蓋骨が薄くされると、小さな血管が見えるようになります。
3. マイクロブレードは、頭蓋骨の安定性に関する多くの触覚フィードバックを提供するように、生理食塩水で間伐の最終を達成するために無菌歯科マイクロブレードを使用してください。これだけではドリルよりもはるかに薄く準備することができます。我々の経験から、最適な頭蓋骨の厚さは10〜30μmである。
   1. 薄い頭蓋骨のウィンドウを作るのが最初の数試行中に落射蛍光複数回の下で頭蓋骨の薄さを確認することが重要です。目に見えるミクログリアと血管系のシャープさと深さは、ウィンドウがイメージングのための準備ができたときに、的確な指示を与える。
4. ウィンドウには、接着剤＃0カバーガラスwiのカスタムメイドの長方形の部分、準備が整ったらウィンドウ上の各側に2mm未満の次元目。 1.0 mmの直径のガラスピペットを用いて、間伐頭蓋骨のエリア上にシアノアクリレート接着剤の小滴を配置し、カバースリップの小片ダウン慎重に低く、その後接着剤の過剰量を絞り出すために頭蓋骨に軽く押してください。光学的に不透明になるために下に閉じ込められた空気は、地域の原因となりますので、それは、ガラスと接着剤の間に気泡の形成を回避することが重要です。それは、乾燥時に透明なままでも、骨と薄いと半透明のウィンドウの下に頭蓋骨を保つ膜の再生を防ぐためシアノアクリレート接着剤が使用されます。カバーガラスの上に接着剤がある場合は、カバーガラスが設定されていて、接着剤が乾燥した後、慎重にそれを削除するためにマイクロブレードを使用してください。
5. 鎮痛剤（例えば、ブプレノルフィン2 mg / kgの皮下に）すぐに手術後に投与し、移動、食事や飲みに不本意を含む痛み、体重減少、流涎、立毛、呼吸音の兆候で再投与され、など

3。二光子イメージング

1. 二光子イメージングのための準備として、生理食塩水でTSCWをカバーし、落射蛍光（図2）の下に関心の領域を見つけます。地域のその後のイメージングを有効にするには、写真用カメラを使用して撮影してください。
2. 二光子イメージングのために、我々は、Tiとカスタムメイドの二光子顕微鏡^6を使用してください：サファイアレーザーは920 nmに調整されています。蛍光は全フィールド検出モードと180分の580発光フィルターに光電子増倍管を用いて検出される。 20X水浸レンズ（0.95 NA）は、イメージングセッション全体で使用されます。目的のレーザーパワーの最大出力は50から65 mWの間に設定されています。
3. 皮質層IまたはII（軟膜表面下最大150ミクロン）への関心の領域を選択します。再イメージングを容易にするために、1X、2Xでビューの同じフィールドの写真を撮って、3倍デジタルズーム。血管が簡単に、後続のイメージングセッション中にビューの同じフィールドを見つけるために目印として使用できます。時間をかけてミクログリアの形態と行動の良好なサンプリングを可能にする30分、最大で80〜90と3倍、複数のz -スタックのズームの下に各スタック内のZ -手順と0.69μmのステップは5分ごとに取得することができます（図3）。 Z -スタックの買収との間で、一TSCW以上生理食塩水のレベルだけでなく、麻酔の動物の深さを確認する必要があります。

4。 HIV - 1神経毒、タットの注入

1. 最初に、35ゲージの針およびTat沈着を防ぐために10μL微量注射器の内側のライニングをsilanize。それは、針と注射器の両方を使い切るまで、シラン溶液（Sigmacoteを）撤回する。ソリューションは、室温で5分間静置することができます。シリンジからのソリューションを空に、プランジャーを削除し、注射器と針が完全に乾かします。最後に、脱イオン水で十分に注射器と針を洗浄する。
2. 二光子画像は、得られる小さなドリルビットを使用し、鋭い先端と鉗子のペアがの間伐層を除去できるようになるまで慎重に頭蓋骨を薄くしているTSCWに吻側または横方向の3ミリメートルのいずれかの直径の小さな開頭0.5mmの実行簡単に離れて骨。我々は、3軸マニピュレータに搭載されたUltramicropump IIIのシリンジポンプによって制御される35ゲージの針を備えた10μL微量注射器を使用し、開頭に針先を合わせてから、それは以下の700から900μmの深さに慎重に進んでいる3μLタット_1から72（または他の炎症誘発剤）または生理食塩水（またはコントロールのビークル）軟膜表面を80 NL / minで配信されます。

5。動物ハウジング

1. 動物は一日に複数回撮像する場合は、眼軟膏とイメージングのセッションの間に不快感や頭蓋骨への損傷を防ぐためにワセリンの混合物と頭蓋骨のオープンエリアをカバー。小型のヘッドプレート（図1Bを参照）からのサポート、ブリッジを切断し、簡単にアクセスできる食料と水を暖めたケージに動物を配置。すべての動物はすべての回で手術後に単独で収納することがあります。動物用のイメージングセッションが特定の日に完了すると、慎重にヘッドプレート全体を削除し、＃6または小さい縫合糸で頭蓋骨を介して背部皮膚を縫合。再び、家の実験日の間に容易にアクセス可能な食料と水と動物が単独で。ストレス、痛み、または感染の形跡がないか毎日動物を確認してください。

6。代表的な結果

図1手術と2光子イメージング（A）とヘッドプレートの設計（B）のための動物の安定化。

図2。GFP標識されたミクログリアは、落射蛍光で視覚化。

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図3。 GFPで標識されたミクログリアはTSCWの移植後の二光子励起イメージング、軟膜表面下約50μm。単二光子15〜30分TSCWの移植（0日）後に採取したセクションだけでなく、7 を可視化し、 17日後に、ミクログリアは炎症侮辱のない状態で不活化したままでWindowsが明確にとどまることを示している。 Z -突起6を取られ、24時間活性化ミクログリアのHIVの神経毒TAT展示印象的な形態学的変化のポスト噴射。スケールバー：10μmである。

ディスカッション

HIV - 1関連神経認知障害（HAND）の実際の基板はおそらくHIV - 1感染単核食細胞から放出される炎症促進性メディエーターによって引き起こされるシナプスアーキテクチャの破壊、であることがコンセンサスがある。ミクログリアの活性化、多核巨細胞、およびアストロサイトの肥大に起因する神経膠症は中枢神経系⁷のHIV - 1感染及び炎症の非特異的な特徴とみなされます。対照的に、殺す前に起こった神経疾患の重症度は、シナプスの複雑さの損失だけでなく、CNS ^8,9,10,11のマクロファージ負担と相関している。しかし、ミクログリア、末梢浸潤マクロファージ、およびHAND患者におけるニューロン間の動的相互作用は、単に従来の免疫細胞化学的研究から得られた従来の静的な処理を用いてモデル化することはできません。我々の研究室から最近の研究では、末梢および中枢単核細胞とニューロン間のこれらの相互作用の少なくとも一部は脳実質（呂、マーカー、Tremblayさん、にHIV - 1タンパク質タット_{1から72まで}の定位注射によって部分的にモデル化できることが示唆されている気、およびGelbard、未発表データ）。したがってneuroAIDSため扱いやすい小型の動物モデルにおいて、単球由来のマクロファージ、脳の常駐ミクログリアとニューロン間の相互作用を調べるためにin vivoで二光子イメージングに適用することを決めた。オープン頭蓋骨や間伐、頭蓋骨の準備は時間の短い期間（時間）のための皮質構造の単一の検査をできる一方で、亜急性のイベントのタイムコースに興味がある研究者は、人為的原因の外科的処置にミクログリア/マクロファージを活性化することなく、これらの製剤を使用することはできません。頭蓋冠のウィンドウ。ここでは、接着TSCWで回生から頭蓋冠を防ぐだけでなく、≥3週間のための半透明性を維持する間伐頭蓋骨の領域の上にガラスのカバースリップの小片で、これらの制限を回避する簡単な方法を示しています。我々はさらにこの技術は、私たちは（CX ₃ CR ₁ / GFPのためのヘテロ接合体マウスの大脳皮質におけるHIVタット_{1から72まで}の定位注射に反応して脳微小血管系だけでなく、脳常駐ミクログリアを入力する末梢単球の挙動を監視することができることを示している単核球系統の細胞を同定する）。このテクニックは、簡単に異なる遺伝的背景を持つマウスで使用するために適応させることができ、例えば、我々は日常的にヘテロCX ₃ CR ₁ / GFPを使用してX汝- 1単球由来のマクロファージ、脳の常駐ミクログリアとニューロン間の相互作用を調査するためにYFP ^12匹のマウスHANDに関連する神経炎症の in vivoモデルインチ私たちのTSCWの準備は、研究者が周囲と動物が繰り返し実験的治療の前後に撮像​​することのできる数週間の期間、以上発生する可能性のある中枢神経系との間の細胞間相互作用を研究することができます。このように、各動物には独自のコントロールとして機能することができます。このTSCWモデルの一つの注意点は調査中の標的細胞は、どちらか遺伝的に強化された蛍光タンパク質（eXFP）を発現したり、頭蓋冠の機械的な違反せずに蛍光色素で標識される設計でなければならないということであり、そのeXFPの式は、十分に堅牢でなければなりません細胞構造は数週間の期間にわたって繰り返さイメージングセッションの後に視覚化することができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fentanyl Citrate	Hospira Inc.
Midazolam hydrochloride	Baxter Internationl Inc.
Medetomidine hydrocholoride (Domitor)	Pfizer Pharma GmbH
Heating pads	Beyond Bodi Heat
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)	Alcon
Povidone-iodine 10% solution	Betadine Puredue Pharma
Ferric chloride 10% solution	Ricca Chemical Company	3120-32
Methyl cyanoacrylate 910	Permabond
Cyanoacrylate 454	Loctite
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate	Co-Oral-lte Dental Mfg CO
Microtorque II handpiece kit	Pearson Assessments	R14-0002
IRF 007 drill bits	Fine Science Tools	19008-07
Norland bendable microblade full radius	Salvin Dental	BLAD-NORLAND-69
Cyanoacrylate	The Original Superglue
#0 glass coverslip	Electron Microscopy Sciences	63750-01
10 μl Microvolume syringe	World Precision Instruments, Inc.	ILS010LT
UltraMicroPump III	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1
35 gauge NanoFil needle	World Precision Instruments, Inc.	NL35BL-2
Ball Mill, Carbide bits #1/4	World Precision Instruments, Inc.	501860
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100
Photomultiplier tube	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Ti:Sapphire laser Mai-Tai	Newport Corp.