成虫（A. gambiae）におけるRNAiのアッセイのためのプロトコル

要約

逆遺伝学的アプローチは、蚊のベクトルの病原体にどの遺伝子が基礎となる抵抗を決定するための非常に有用であることが証明されている。このビデオプロトコルは、マラリア原虫を抱いているハマダラカ蚊、にdsRNAを注入するDimopoulosラボで使用される方法を示しています。インジェクションのセットアップを操作し、胸部にdsRNAを注入する手法が示されている。

要約

逆遺伝学的アプローチは、蚊のベクトルの病原体にどの遺伝子が基礎となる抵抗を決定するための非常に有用であることが証明されている。このビデオプロトコルは、マラリア原虫を抱いているハマダラカ蚊、にdsRNAを注入するDimopoulosラボで使用される方法を示しています。インジェクションのセットアップを操作し、胸部にdsRNAを注入する手法が示されている。

プロトコル

蚊におけるRNAiによる遺伝子サイレンシングは、目的の遺伝子を標的と特定のdsRNAの事前準備と浄化が必要です。 dsRNAの合成のため、我々は、in vitro転写反応での T7 RNAポリメラーゼを介したを利用するAmbion社のMegascriptキットをお勧めします。 dsRNAの精製のために、我々は、キアゲンをRNeasyキットをお勧めします。 dsRNAのサンプルを定量化して、水の3μg/μLのために調整する必要があります。あなたが必要とする他の材料は、次のとおり先の細いピンセット、スライドガラス、ガラスマイクロキャピラリー針、マイクロインジェクター（我々はドラモンドのNanoject IIを使用する）、コールドブロック、カバーガラスのペトリ皿、紙タオルや氷のバケツの上にマウントされている光学顕微鏡を。また、10％ショ糖に浸したコットンボールのような食料源と一緒に蚊とそれらに適したコンテナを収集する方法が必要になります。

1. あなたの蚊を集める 。バッテリ駆動アスピレーターを使用して、注入する蚊を集める。ペーパータオルや綿は蚊がリザーバーをエスケープしないと削除することができるように、ノズルを差し込みます。寒い温度が蚊を麻酔するので、氷のバケツに貯水池を埋めると移動を止めるために蚊に5〜10分待ちます。麻酔は、低温室や冷蔵庫に貯水池を配置することにより、またはCO _2を使用することによって達成することができます。これらの5〜10分時には、次の手順に進みます。
   
   
2. あなたの作業領域を準備します 。2 ° Cに平らな面コールドブロックを設定し、その上にスライドガラスを配置。これは、あなたがそれらを注入すると蚊が休息する場所です。インジェクターにガラス針を添付し、目的の幅に針の先端を破るために、ピンセットを使用してください。それは幅が液体のための十分な余地が合理的な速度で流れるように十分な大きさであることが重要であるが、注入中に最小限の傷を負わせるのに十分狭いです。良い針の先端はわずかに曲げるのに十分な狭いかもしれませんが中断されません。希望の出力ボリューム（RNAiに、我々は69 NLを使用）にして噴射装置を設定します。水没してサンプルにして針の先端とメーカーの指示を使用して針にして液体試料を描く。液体サンプルは、dsRNAのソリューション、細菌懸濁液、または他のことができ、注入プロセスはすべて同じです。皿の底が完全に氷に接触されるように氷のバケツにガラスのシャーレを埋め込みます。これは、それらを注入する準備が整うまでは、蚊を置く場所です。
   
   
3. あなたの蚊を準備します 。貯水池からのガラスシャーレに50から100蚊を転送。最も彼らは麻酔を維持するために皿の冷たい底部との接触を持っていることを確認して、単層にそれらを薄くするために、ピンセットを使用してください。使用しない時はカバー皿で、これらの蚊をカバーする。蚊の残りの部分に麻酔を保つために氷のバケツに貯水池を返します。
   
   
4. コールドブロックに蚊をマウントします 。皿から光顕微鏡下でコールドブロックにマウントされているガラスのスライドに一度に蚊つを転送するように先の細いピンセットを使用してください。望ましいの足で、軽く蚊を扱う。ラインアップスライド上で、多くの30のような蚊のside - by - sideを、あなたがインジェクターとし、それぞれが冷たいスライドに接触することを確認し、それぞれに得ることができることを確認して。あなたの蚊があなたに沿って行くとあなたが持っていると注入されていないものを知るように整然と並んでいることを確認してください。チルドペトリ皿で​​覆われた他の蚊にしておきます。
   
   
5. 蚊のあなたの最初のグループを注入する 。片手であなたの先の細い先端がピンセットを持って、鉛筆のような一方で、インジェクターを保持する。あなたが必要として、蚊を移動するには（怪我を避けるために足でそれらを処理する）と、注入のように蚊を安定に保つための鉗子を使用してください。あなたが他の側から注入すると蚊の片側をサポートするための鉗子を使用する場合に最適です。慎重に蚊の胸部に単に針の先端を挿入します。怪我を最小限に抑えるためにキューティクルのピンと張ったまだ薄い部分に注入するのが最善です。また、あまりにも深く注入することは避け、あなただけの先端が胸部の内側になりたい、より深い注射は、生存を危うくされる大きな傷を起こす。針の先端が所定の位置になると、dsRNAのあなたのあらかじめ設定されたボリュームを配信するインジェクター装置のフットペダルを押して放します。 1〜2秒待ってから、蚊から針を取り除く。液体のドロップは、創傷部位の外側に表示された場合、それは傷口に吸収されるまで数秒待ちます。それが数秒以内に吸収されない場合は、その蚊を破棄して再試行してください。あなたのスライドガラス上のすべての蚊の注入工程を継続する。
   
   
6. あなたの蚊を格納する 。作業が完了したら、表示した容器内部に注入された蚊を置く（私達がによってカバー1パイントワックス裏地段ボールのカップを好む）ネッティングとラバーバンドと段ボールの蓋で固定メッシュ。
   
   
7. 終了するまで注射を続けます 。、スライド上に蚊を配置するために継続注入し、あなたが望むサンプルサイズになるまでカップに移す。一部の死亡 - 初心者のためのアカウントは、多くの蚊は、注射のトラウマから死ぬ必要があります。あなたの蚊のほぼ100％が注射を乗り切るまでは、これで練習して上達するでしょう。
   
   
8. 終了したら、食の源と一緒に飲みながら折ら、ぬれたペーパータオルを配置し、そのようなプラスチックのラップまたはプラスチックシャーレの蓋などの水分を保持するために何かでカップをカバー。注入された蚊は、ぬれたタオルで提供されるとプラスチックが保持する水分は、これを防ぐに役立つように乾燥しがちです。
   
   
9. インキュベーションのための環境制御室で蚊を置きます。

注 ：遺伝子サイレンシングの効率が非常に多様であり、細胞や臓器によって転写とタンパク質のターンオーバー率、およびdsRNAの取り込み効率を含む多くの要因によって異なります。私たちは、サイレンシングは、1日の注射後には早くも始まる、と6日後に注射するまで持続できることを見出した。定量PCRとウェスタンサイレンシングを検証するためにブロッティングなどの転写産物とタンパク質の検出方法を使用してください。

注 ：蚊注射とRNAiによる遺伝子サイレンシング技術のいくつかのステップでいくつかのバリエーションがあります。いくつかのバリエーションによって記述されています：Boisson、 ら （2006）とブランディンら（2002）。。。

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ディスカッション

遺伝子サイレンシングの効率が大きく変化すると細胞や臓器によって転写とタンパク質のターンオーバー率、およびdsRNAの取り込み効率を含む多くの要因に依存します。私たちは、サイレンシングは、1日の注射後には早くも始まり、6日後に注射するまで持続できることを見出した。定量PCRとウェスタンサイレンシングを検証するためにブロッティングなどの転写産物とタンパク質の検出方法を使用してくだ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond Scientific	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos