のマウスモデル子宮内で移植

要約

のマウスモデル子宮内で移植は、胎児の幹細胞移植や遺伝子治療の潜在的な臨床応用を研究するために使用できる多目的なツールです。このプロトコルでは、我々はこの手法を実行する一般的なアプローチを提示

要約

子宮内で幹細胞とウイルスの移植は、ヒトの胎児に先天性疾患を治療するための大きな可能性を秘めています。例えば、造血幹細胞の子宮内移植（IUT） で正常にいくつかの他の条件で重症複合免疫不全^。1,2の患者を治療するために使用されている、しかし、IUTが成功することなく試みられている^。3に、これら^の混合の結果を考えると、可用性が幹細胞移植や遺伝子治療の生物学的後遺症を研究するために効率的なモデル非ヒトからこの分野を前進させることが重要です。我々と他の野生型マウス^4-7、遺伝性疾患とのそれら両方の子宮内移植造血幹細胞の生着の成功に影響を及ぼす要因を調べるためにIUTのマウスモデルを使用している^。8,9胎児の環境もかなりの利点を提供子宮内遺伝子治療での成功。例えば、アデノウイルス¹⁰の配信、アデノ随伴ウイルス^10は 、胎児へのレトロウイルス^11、およびレンチウイルスベクター^12,13は、長期的な遺伝子発現による注射部位から遠く離れた複数の臓器の形質導入をもたらした。 子宮内で遺伝子治療は、したがって、そのような筋ジストロフィーや嚢胞性線維症のような単一遺伝子疾患の可能な治療戦略として考えることができる。 IUTのもう一つの潜在的な利点は、特定の抗原に対する免疫寛容を誘導する能力です。として血友病、この蛋白質に対する耐性の早期開発の成果の第IX因子の導入とマウスで見られる^。14

潜在的な人間の治療法を検討する上での使用に加えて、IUTのマウスモデルでは、発達と幹細胞生物学の基本的な質問を研究する強力なツールとなります。例えば、一つの誘導または阻害する特異的な遺伝子発現が定義されて妊娠の段階でと発達経路を操作するための様々な小分子を提供することができます。これらの変化の影響は、最初の移植後の種々の時点で評価することができます。さらに、一つは非照射の幹細胞の分化を研究するために胎児の環境に多能性や系統特異的前駆細胞を移植し、ホスト環境を摂動することができます。

IUTのマウスモデルは、すでに免疫学の分野、及び発達と幹細胞生物学の中で数多くの洞察を提供しています。このビデオベースのプロトコルでは、我々はマウス胎児でIUTを実行するためのステップバイステップのアプローチを説明し、重要なステップと、この技術の潜在的な落とし穴を概説。

プロトコル

1。インジェクションピペットの準備

1. ガラスピペットの分離は15秒（キャリブレーションについては、製造元の指示を参照）内で発生するようにピペットプラーをキャリブレーション。ピペットは、それが分離テーパーを持つことになります。
2. テーパーの初めからピペットの端までの距離が1.05センチメートルに1.04センチメートルになるようにピペットの先端をカット。ピペットの長さは、ピペットのオリフィスの口径に反比例します。注入時の破損を受けやすい弱い先端でも、結果長いピペットを作ることに注意してください。
3. ピペットを作るための次のステップでは、ダイヤモンドシャープホイールの先端をシャープで滑らかなベベルを作成することです。適切なサイズにピペットを切断の時に、ピペットは、多くの場合、ホイールにピペットを配置する際に使用されている必要があります、その先端に自然のベベルで分割されます。このプロセス中に、それは静かにシャープホイールのピペットを休ませ、定期的にピペットはまだホイールに触れている（ベベルがスムーズになると、それはシャープホイールとの接触を失うことになる）を確認するために再評価することが重要です。
4. ベベルがスムーズになると、ピペットの先端を（図1）鮮鋭化されている必要があります。それはもはやシャープホイールに触れていないようにピペットを高める、それが10から50度時計回りに回転させる、と〜10秒間回転するシャープホイールにピペットを取り付けなおします。シャープホイールからピペットを撤回し、今エッジを調べます。このステップでは、通常、鋭いエッジを作成するには、いくつかの小さな調整を繰り返す必要があります。ピペットが長すぎるために、そのエッジに配置されている場合、それは表面に凹凸（図1）を開発する可能性が高くなります。片側が完了したら、上記手順を繰り返すことで、反対側のエッジをシャープに進むことができます。
5. すべての4ミリメートルピペットのテーパーが始まる場所を開始円周線を描画するために永久的なマーカーを使用してください。これら境界は、ボリュームの5ULに対応しています。

（2） 子宮内移植で

1. 注射材料（例えば、細胞、ウイルス、等）を準備した後に、注射のために設定することができます。私たちは、次の設定で圧縮空気に接続されているマイクロインジェクターを使用して：（圧力の設定：入力60から80 PSI、40 PSIを埋めるため、8月12日PSI、バランス0 PSIを注入し、0 psiを保持、注入時間100ミリ秒）。
2. インジェクションピペットを滅菌するために、滅菌1 × PBSで2回に続いて70％エタノールで2回清掃してください。ピペットの先端は非常に壊れやすいですので、我々は、注入ピペットをオートクレーブ滅菌することはお勧めしません。
3. 注射は、どちらか2.5X - 3.5Xの倍率のルーペや解剖顕微鏡を使用して行うことができます。温暖化の毛布、照明、および必要な手術器具を使用してプロシージャ領域を準備します。
4. 妊娠中のマウスを（我々は連続的な流量麻酔のユニットを介して配信イソフルランと酸素を利用する）麻酔。場所でマウスを固定するテープで各肢仰臥位と接辞で加熱パッド上でマウスを置きます。
5. 毛皮をクリップ。その後、準備は10％ポビドンヨードアルコールが続く、とブプレノルフィンなどの鎮痛剤などを注入すると、滅菌手術用手袋を腹部着用。
6. 下腹部（切開の最も劣る面が入り口に約1cmよりも優れているはず）で1センチメートル切開を加えます。皮膚と筋膜を切開する。筋膜の薄層の直下に、腹部臓器（腸や膀胱）を傷つけないよう注意してください。
7. 綿棒を使用して、軽く筋を伸ばすと、切開して妊娠子宮を提供。まず全体の子宮を視覚化を確認​​するために、左右の卵巣を識別することによって胎児の総数を数えます。あなたが注射の準備をしながら胎児は暖かいままになるように進む前に腹腔内に戻って子宮を置きます。
8. あなたが注入を計画して胎児の数のために材料の適切なボリュームを上げて描く。あなたのサンプルを使用してニードルを充填しながら、それは、インジェクターチューブに、サンプルを吸引を避けるために水没ピペットの先端を保つことが重要です。ピペットチップを壊すことなく針を埋めることができるようにチューブまたは直接パラフィルムの一部について：細胞は少量の一般的なので、我々は通常、小さなマイクロ（0.5mLを例）に置きます。
9. ゆっくりとそれぞれの胎児を保持し、注入を計画して胎児（例えば肝臓、腹腔、足、等）の一部を識別する。もし注射を行っている間、それが回転しないように親指と人差し指を使って、羊膜腔内で胎児を安定させる必要があります。静かに十分な損傷を防ぐために、まだそれを安定させるためにしっかりと十分な胎児を保持することが重要です。
10. 慎重に子宮、羊膜、および胎児の皮膚を介してピペットを挿入し、標的臓器に。ピペットがシャープである場合、それはこれらの組織を介して簡単に渡す必要があります。ピペットの先端が鈍いの場合は、ウィスコンシン州子宮と羊膜のテンティングに注目しよう。各胎児に必要なボリュームを注入する。それはあなたの動きが挿入、注射、及びピペットの撤退の時に安定であることが不可欠です。
11. 目的のボリュームが注入されると、慎重にピペットを撤回。適切に行われれば、材料は羊膜腔や子宮から漏れ出してはいけません。大きな穴が1つは、羊水の漏れによって認識できる羊膜、内に作成されている場合、生存が脅かされている。出産後の注入とuninjected胎児を識別する方法がないので、最後に、出生後の収穫を伴う研究のために、すべての胎児は、技術的に完璧な注射を受ける必要があります。
12. あなたが胎児の肝臓に注射を実行している場合はそれが取り下げ - これがされた後、あなたは時々ピペットの先端に血液が表示されることがありますあなたが正しい位置に確認して、生存には影響を与えません。腹腔内注射を行う場合、わずかに胎児の肝臓の下に目指しています。筋肉内注射では、股関節と大腿骨を識別し、大臀筋を注入するために胎児を位置決めすることができる。最後に、脳室内注射のために、それが適切なターゲットにピペットを指示するために冠状縫合糸を簡単に確認することができます。これらの注射のために、少し大きめの口径のピペットは、ピペットを壊すことなく頭蓋骨を貫通する必要があります。
13. 次に、腹腔内に戻って子宮に静かに置きます。それは自分自身でまたはその血管供給の周りねじれていないことを確認してください。手順中に失われた任意の流体を置き換えるために、母親の腹膜腔に滅菌1X PBSを1mLのを提供します。 5から0編組吸収性縫合糸（：Vicryl EX）との2層の切開を閉じます。最初の基本的な腸や膀胱を傷つけることなく、筋膜を閉じて、皮膚を​​閉じます。
14. この時、後の手続きの薬は、鎮痛のために投与することができます。独自の個々のケージにそれぞれ注入された女性を返すと温暖化の毛布の上にケージを置きます。それが直立になるまでマウスを監視する。ケージにベッドを入れて、それは出産後数日まで（ないケージの掃除をすなわちしない）邪魔されるべきではないマウスの施設の静かなエリアにマウスを置きます。動物のための追加のストレスを最小限に抑えることにより、切迫早産の可能性を減少します。
15. もし注射を完了したら、滅菌1 × PBSで2回あなたのピペットをきれいにし、一回で70％エタノール。
16. 注入された女性は簡単に彼らがプロシージャから回復している保証するために、毎日観察する必要があります。切開は感染の腫れ、炎症、創傷の分離、および他の徴候を監視する必要があります。必要に応じて術後の鎮痛薬を投与することができる。

3。代表的な結果：

短期納品に注入された胎児の生存率は、この手法で成功を達成するための主要な制限要因である。材料を注入し、マウスの系統が使用されてに応じて、生存率が異なることがあります。一般的には、E14での野生型マウスに造血細胞の注射は、少なくとも50％のライブ生まれの仔になるはずです。生存率が高いが注射の技術的側面だけでなく、注入されるマウスの両方の特性に応じて可能です。

子宮および羊膜への外傷を最小限に抑えることにより、このプロトコルの最も重要な技術的な側面です。シャープ、小口径のピペットは、注入時の最小限の子宮外傷になります。私たちは、プレハブ針の口径として標準的な注射針を使用することはお勧めしませんが大きすぎると子宮に大きな穴になるだろう。手作りのガラスの注入ピペットは子宮内の注射のために利用することができる唯一の小口径の針です。子宮の穏やかなハンドリングと短い麻酔薬を含め、慎重かつ細心の手術手技は、また最適な結果を得るために重要です。

遺伝的背景などのレシピエントマウスの特定の特性、在胎週数、および産仔数はまた、生存に影響を与える可能性があります。マウスの特定の株は、彼らの遺伝的背景に応じて、切迫早産と妊娠の損失を受けやすくなります^。15トランスジェニック動物は、筋肉や神経変性の欠陥で正中開腹術を受けた後に経膣的に胎児を提供する障害能力を持つことができる^。8これらの妊娠中の女性は配送が必要な場合があります帝王切開。我々はまた、注入時の在胎週数は生存率に影響を与えることができることを見出した。胎生12日目よりも日付の古い胎児は古い胎児よりも生存率が低いを持っている。最後に、我々は、大きなゴミのサイズが（> 10胎児）注射後の胎児死亡の率が高い傾向にあることを発見した。この手法の技術的側面と注入された胎児の生存率を最大化することができます注入されるマウスの特定の特性の両方に注目。

ve_content">これらのメソッドが正しく実行されるときは、1つのすべての胎児が注入物質にさらされていることを期待することができます。生後設定と同様に、しかし、 子宮内の細胞やウイルスの配信成功は常にドナー細胞移植や遺伝子が発生しないそれぞれの式、。幹細胞の生着は、例えば、移植細胞の投与量やソースなど、いくつかの要因に依存しています。同様に、ウイルスの形質導入の成功は、部分的に使用されるウイルスベクターの種類によって決定されます。一つは、インパクト子犬生存、細胞の生着、およびウイルス形質導入は、このプロトコルで成功を達成するために多数の要因を理解する必要があります。

図1図は、インジェクションピペット（ステップ1.4）のシャープ化を適切に描写する

ディスカッション

50年以上も前、ビリンガム、ブレント、そしてメダウォアは外国のタンパク質に対する免疫寛容を誘導するためにマウスで子宮移植で使用されている^。16はその時以来、このテクニックのいくつかのバリエーションは、免疫学、幹細胞生物学の問題に対処するために使用されている。

ここで詳細なプロトコルは、IUTのための最もアクセスのいずれか?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipettes	Kimble Chase	71900-100
Pipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-30
Microinjector	Narishige International	IM-300
Pipette sharpener	Sutter Instrument Co.	Model BV-10