高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

要約

彼らはネイティブの微小環境での進化として、多くの生物学的および臨床的状況では、細胞プロセスを研究するのが有利である。ここでは、細胞培養、動物実験、および患者の臨床試験ではリアルタイムイメージングを提供できる低コストの光ファイバ顕微鏡の組み立てと使用方法を説明します。

要約

多くの生物学的および臨床研究は、細胞レベルの分解能を持つ形態と機能の縦断的研究と分析が必要です。伝統的に、複数の実験は、光学顕微鏡による評価のためのシーケンシャル時点での研究から削除される個々のサンプルで、並列に実行されます。いくつかの生体内の技術が共焦点、多光子、および第二高調波顕微鏡はすべてその場 ¹ のイメージングに使用する能力を実証するとともに、開発されている。これらのシステムでは、しかし、必要なインフラは、走査型レーザーシステムや複雑な光源を含む、複雑で高価です。ここでは、5,000米ドルの下でのための既製のコンポーネントを使用して一日で構築することができる高解像度のmicroendoscopeの設計と組み立てのためのプロトコルを提示する。プラットフォームは、画像解像度、視野、および動作波長の面で柔軟性を提供し、我々はこれらのパラメータを簡単にエンドユーザーの特定のニーズに合わせて変更することができる方法について説明します。

我々と他の人は、in vitro細胞培養^2-5、6を切除して生きている動物組織^2,5において、 および in vivo ^2,7 のヒト組織での高解像度microendoscope（HRME）の使用を検討されている。ユーザーは、プロフラビン^2-4、ベンゾポルフィリン誘導体一酸リング（BPD - ^MA）5、およびFDAから完全な、または治験承認を受けたすべてがフルオレセイン^6,7、を含むいくつかの異なる蛍光造影剤の使用を、報告しているヒト被験者での使用のため。高解像度microendoscopyは、ここで説明する形で、基礎および臨床科学で働く研究者の広い範囲に上訴することがあります。テクニックは、ユーザがその場で高解像度、縦方向のイメージングを実行できるようにすることで、従来のベンチトップ型顕微鏡を補完する効果的かつ経済的なアプローチを提供しています。

プロトコル

1。 Microendoscopeアセンブリ

ここで説明する高解像度microendoscope（図1a）は、アセンブリとアプリケーションで可能ないくつかのバリエーションがある基本構成として考慮されるべきである。ここでは詳細に蛍光造影剤としてのプロフラビンで使用するように設計されているプラ​​ットフォームの実施例を説明します。プロフラビンは、それぞれ445 nmと515 nmのピーク吸収および発光波長で染色明るい核があります。他の造影剤の使用は、ユーザーが適切に励起、発光、およびダイクロイックフィルタを選択することが必要になります。高解像度microendoscopeのいくつかの要素は汎用性があり、複数のベンダから入手することができます。例えば、オプトメカニカルコンポーネントの配置は、とりわけThorlabs、ニューポート、リノスから入手できます。コンパクトCCDカメラは、ポイントグレーリサーチ、Prosilicaは、とRetigaなどのメーカから提供され、カメラの感度は、使用する蛍光体の明るさだけでなく、目的のフレームレートを考慮して選ばれるべきです。ハイパワー発光ダイオード（LED）はとりわけのLuxeon、Cree社、日亜から得ることができる。光ファイバーバンドルは、住友、フジクラ、およびショットから入手可能です。特定のアプリケーション用のコンポーネントを選択するには、ユーザーは、照度、カメラの感度、ゲイン、および露光時間を退色、蛍光体の濃度との間の蛍光顕微鏡に関わる固有の関係を考慮する必要があります。

1. 7.5のペアを形成するために、ケージの棒"を1.5にケージの棒"6接続"長い棒を。折り返しミラーユニットの一方の面にこれらのロッドをネジ0.5ねじ"反対側の面に棒を。スルーホール下の2つを経由して、ケージの棒の上にケージのキューブをスライドさせます。ケージの立方体（図1b）の側面に2"棒をねじ込みます。
2. SM1アダプタにC -マウントを使用してケージのプレートにカメラを取り付けます。 0.5"ケージの棒のケージプレートを固定し、折り返しミラーユニットの前面と平らに揃います。
3. 3"長いレンズチューブに"チューブ"のレンズを挿入し、保持リングとレンズを固定します。投影時にレンズの焦点距離は光ファイババンドルのコアが少なくとも2つのピクセルでサンプリングされるように選択されるべきであるカメラの上に。フィルターメーカーによって示される。の側に鏡筒をネジ第一保持リングの上にチューブに発光フィルターを削除し、代わりにフィルタを確保するために別のリングを追加。フィルターの向きの規則を守ってくださいケージのキューブのCCDカメラに近い。図1cに、このレンズとフィルターは、わかりやすくするために3"のレンズチューブなしで表示されていることに注意してください。
4. カメラとパソコンを接続し、画面上の画像を表示します。遠くのオブジェクトでケージアセンブリを指揮し、被写体にピントが表示されるまでレールに沿ってケージのキューブをスライドさせます。この場所でのケージのキューブをロックダウンできます。 （これは無限遠補正対物レンズと組み合わせるとチューブレンズは、フォーカス画像を形成することを保証する簡単な方法です）。
5. ケージのキューブで45 °のホルダーと所定の位置にダ​​イクロイックミラーを挿入します。
6. チューブレンズホルダー反対ケージの立方体の面に、SM1スレッドアダプタにRMSおよび調整可能なレンズチューブを介して、対物レンズをねじ込みます。 Z -翻訳者が容易焦点のための調節可能なレンズチューブの代わりに使用することができる。ケージのプレートにSMAコネクタをネジ込み、対物レンズの作動距離で約、棒でこれをマウントします。
7. 2の終わりにケージプレートとスライド上のLEDマウントする"棒。0.5にレンズを追加"この管はケージの立方体の側面にネジ止めされている場合、それはLEDの画像を形成するようなレンズチューブそれは、対物レンズの背面開口部を埋める。この（ケーラー照明）の構成は、光ファイバー束の近位面が均一に点灯していることを保証します。 0.5"のレンズチューブに励起フィルターを追加し、保持リング（図1c）との場所に固定します。
8. 光ファイバー束にSMAコネクタを取り付けます。ケージの棒に取り付けられたSMAレセプタクルにSMAコネクタ付きバンドルをねじ込みます。広帯域光源（蛍光灯で十分です）に向かってバンドルの先端を指示し、CCDカメラでバンドル近の顔の画像を観察。繊維束の画像がフォーカスされて表示されるまで、ケージのキューブからのネジ止めまたは外で対物レンズの位置を調整します。個々のコアは（図2）はっきりと見えるはずです。

2。 GRINレンズアセンブリ

microendoscopeの空間分解能は、繊維束の遠位先端にマイクロレンズまたはレンズアセンブリーを取り付けることによって増加することができます。これらの光学系は、代わりに直接組織へのバンドルの先端を置くことで、先端が、それによって光のGUIDによって課された空間サンプリング周波数を増加させる、縮小倍率で組織表面上に結像されるように構成されています繊維束のINGコア。縮小倍率の度合いは、空間分解能の増加、そして同時に、視野に比例して減少に対応しています。勾配インデックス（GRIN）レンズのコンポーネントは、光ファイバーと互換性があり、とりわけGrinTech、NSG、ショット、から入手可能である、と直接繊維束の遠位端に結合することができる。

1. あなたのアプリケーションのための所望の倍率と作動距離でGRINレンズを選択してください。レンズの直径は、で動作するように計画して繊維束のそれを超えていることを確認してください。我々は、繊維束とGRINレンズが前にボンディングに正確な位置合わせのための低消費電力の顕微鏡またはステレオスコープの下に独立した3軸手動位置決めステージにマウントすることをお勧めします。
2. レンズまたはバンドルの顔のどちらかの光学接着剤（例えば、ノーランドのUV硬化接着剤）のドロップを置きます。手動のポジショナを使用して、連絡先に2つのコンポーネントをもたらす。メーカーが推奨用量のUV光へのインターフェイスを公開します。
3. GRINレンズと束ねられたインタフェース、アルミキャピラリーチューブ（スモールパーツ（株））の短い長さを保護するためのジョイントを囲むために使用することができます。エポキシのある場所で共同して安全な上でチューブをスライドさせます。熱収縮チューブは、アセンブリを終了するために使用することができます。

3。 Microendoscopeイメージング

1. 撮像される細胞または組織に造影剤を適用します。培養中の細胞の in vitroイメージングのプロフラビン（PBS中0.01％w / v）を、と短いインキュベーション（<1分）で行われ、完全に洗い流すことができます。 生体外で組織標本のまたは生体組織のイメージングは、染料の可能な以下の局所適用になります。これらの条件の下でプロフラビンの取り込みは、数秒から数分間持続内で可能な撮影で、ほぼ瞬間的であることが判明している。
2. イメージを作成するサンプルと軽い接触で光ファイバ束を配置。文化または ex vivoでの組織標本のときには、イメージング細胞、我々は、撮影時の安定性のためのXYZ軸の手動位置決めステージとのセキュリティで保護された治具に光ファイバ束の先端をマウントすることをお勧めします。

4。代表的な結果：

正しく組み立てられると、microendoscopeは、コヒーレント光ファイバ束を介して中継された落射蛍光顕微鏡として動作します。最適な撮像結果を得るために、注意が3つの主要な条件が満たされていることを確実に注意を払う必要があります。

1. 繊維束の近位面は、システムの完全な解決を達成するために、デフォーカスすることなくCCDカメラ上に結像されるべきである。図2a、b、cはそれぞれ、貧しい人々を中心としたイメージング繊維束の部分、わずかなデフォーカス、および良好なフォーカスを示しています。最適なフォーカスがバンドル面に対して相対的に対物レンズの軸方向位置を調整することによって発見されています。
2. 繊維束の近位面は一様にその完全な直径（視野）を介して点灯します。プロトコルのテキスト（1.7）で説明されているように、これは、ケーラー照明用の照明光学系を構成することによって達成されます。図2dは、均一な蛍光試料が重要な照明の下で対応する結果を示す図2Eに、この好ましい構成で点灯しているときに取得された画像を示しています。後者のケースでは、LEDの構造は、真の試料の構造に重畳この不要なパターンの出現で、その結果、繊維束の面上に結像される。
3. 繊維束の近位および遠位面の両方は、汚れや傷やチップの自由でなければなりません。図2fは、繊維の周囲の5時の位置に小さなチップの形でダメージを、バンドルの顔に接続された破片の存在を示しています。破片は、レンズの紙及びイソプロパノール、または標準の光ファイバのクリーニングツールを使用して、従来の光ファイバコネクタと同じ方法でクリーニングして直面しているバンドルから削除することができます。繊維束の両端は、傷や欠け、またはバンドルがその長さに沿って分解する場合、顔は標準的な手動、または機械的な研磨技術により、平坦な研磨することができますされている場合。我々は、0.5〜1.0μmの紙の上に最後の仕上げで、初期の粗い研磨紙をラッピング12月15日程度をお勧めします。

図3aは、プロフラビンとサンプルの塗装されていない繊維束の光の配置とラベリングに続く、in vitroで 1483細胞のイメージングを示しています。図3bは、空間分解能およびバンドルの先端に結合された2.5倍のGRINレンズが提供する視野の減少の改善を示しています。ムービー1は、マウスモデルにおける乳腺脂肪体のin vivoイメージングで示しています。ここでは0.5 mm外径（330μmの視野）と繊維束は、21ゲージの針を通し、組織に進出した。脂肪細胞は15で、今回の買収で明らかな心周期に起因する動きで、はっきりと見える秒あたりのフレーム数。図3cは、健康なヒトボランティアにおける口腔粘膜、1.5ミリメートル外径（1.4 mmの視野）を持つ大規模繊維束を使用して、この時の画像を示しています。に示すすべての例では、プロフラビン、核ラベリング蛍光造影剤として使用されました。

図1高分解能microendoscope（HRMEを）組み立てる。 HRMEシステムの（a）の模式図。主なオプトメカニカル支持構造の（b）のアセンブリ。 （c）光学要素の追加、照明のLED、およびCCDカメラ。 10"× 8"× 2.5"筐体にパッケージさHRMEシステムの（d）の写真、。

図2。HRMEを設定する。 （a）の貧しい焦点に光ファイバ束とイメージングの例としては、（b）の良好なフォーカスに近い、（C）理想的な焦点。 （d）に、バンドルの遠位先端の均一な蛍光ターゲットはケーラー（均一な）照明下で撮像される。 （e）の均一な蛍光ターゲットでは、オブジェクト上の明らかなソース構造で、重要な照明の下で撮像。 （F）ルース組織や細胞はまた、その周辺部に軽微な損傷を受けやすい繊維束の顔、に固執することができます。

図3。HRMEとイメージング。 （）裸の繊維束（IGN-08/30）プロフラビン0.01％（w / v）の持つ以下のラベリングとイメージングをin vitroで 1483細胞、。 （b）に示すように、同じ1483細胞培養は、（a）、2.5倍のGRINレンズを付けた状態で、繊維束で撮像。プロフラビン0.01％（w / v）の局所適用は、次のin vivoでのヒトの正常口腔粘膜の（c）画像、。

ムービー1。イメージング組織に渡される21ゲージ針の内腔内に450μmの外径の繊維束の挿入を介してマウスの乳腺脂肪パッド。プロフラビン0.01％（w / v）をイメージングの前の繊維の挿入に同じ針を介して画像サイトに配信されました。 ビデオを見るにはここをクリック

ディスカッション

ここで説明する高解像度microendoscopy技術は、 その場で携帯電話の詳細を可視化するための、柔軟で堅牢、そして費用対効果の高い方法で基本的な生物医学および臨床研究の分野で研究者を提供します。我々は、イメージングシステムを組み立てるためのプロトコルを記述し、そのin vitroでの細胞培養に、動物での使用、およびin vivoでのヒト組織を示している。ここで紹介するイメージング結果は蛍光造影剤としてのプロフラビンを使用しながら、他のグループ^5-7他の色素の励起/発光スペクトルと一致するように選択されたLED照明の波長とフィルタを使用してシステムのバージョンを示している。

解像度と視野が最初にコア間の間隔と光ファイバ束の結像直径によって決定されます。我々は約4μmのコア - コアの間隔、および330μmの（動画1）、720μmの（図2、図3A、B）、および1400ミクロン（図3c）の像の直径とのバンドルを使用している。小さい束は狭いゲージの針に通し、大きな繊維よりもはるかに柔軟性がありますすることができます。我々と他の^8は 、いくつかのケースでは、繊維束自体からの自家蛍光の排出量の外観を指摘している。 UV波長で蛍光体を励起する、または赤色のスペクトル範囲内の放射を収集しようとすると、注意が全体的な測定信号に寄与する繊維束の自家蛍光のレベルを払う必要があります。

高解像度microendoscopyの作業のほとんどは、最新の裸の繊維束を使用していると報告しながら、追加の倍率は、遠位端に結合されたGRINレンズの使用により提供することができます。 GRINレンズは、光学収差と限られたNAへの感受性がよく認識されているものの、空間分解能を向上させる簡単かつ経済的な方法を提供します。 GRINレンズの性能は、特定のアプリケーションには不十分である場合は、ハイブリッドGRIN /球面レンズの目標を⁹またはミニチュア対物レンズアセンブリ^{10から11を}用いること^ができる。

高解像度のmicroendoscopeは本質的に広視野落射蛍光顕微鏡として動作ここで説明するので、光学セクショニングは、（共焦点または非線形顕微鏡のように）予想されるためです。我々の経験では、造影剤として455 nmの励起光と局所プロフラビンを用いて、光は主に少数の細胞層に相当する深さから収集されます。

このプロトコルは、読者が10のコンパクトなフットプリント"× 8"で、ベンチトップでの高解像度microendoscopeを組み立てるために有効にするはず。必要に応じて、システムは、ボックスとバッテリーパック（図1d）を搭載した電気部品（LEDとカメラ）で囲むことができます。多くのコンパクトカメラは、ホストコンピュータのIEEE - 1394（FireWire）とUSBポートから給電することができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD camera	Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED	Thorlabs Inc.	M455L2	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Excitation filter	Semrock	452/45	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Emission filter	Semrock	550/88	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	485 DCLP	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Objective lens	Thorlabs Inc.	RMS 10X
Tube lens	Thorlabs Inc.	AC-254-150-A1	Select focal length to achieve required magnification to CCD
Condenser lens	Thorlabs Inc.	ACL2520
Cage cube unit	Thorlabs Inc.	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
Cage rods and plates	Thorlabs Inc.	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
Fold mirror unit	Thorlabs Inc.	KCB1, PF10-03-G01
Lens tubes	Thorlabs Inc.	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)
Adapters / couplers	Thorlabs Inc.	SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
SMA connectors	Thorlabs Inc.	SM1SMA, 11040A
LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B TPS001
Fiber optic bundle	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	IGN-08/30	Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)