ブラックウィドウスパイダーシルクを生産腺の顕微解剖

要約

ここでは、女性の黒い未亡人のクモの腹部から、絹を生産腺を除去する効率的な戦略について説明します。この手順では、高度に精製されたファッションの7つの別のシルク生産腺、クモの糸生産と繊維集合体を研究する研究者のための重要なプロセスの迅速な分離が可能になります。

要約

現代のスパイダーは、子孫の^1,2の開発の運動、餌捕獲と保護を含む生物学的機能の広い範囲で高性能な絹繊維をスピン。スパイダーは、多様な機械的性質を持っているいくつかの異なるファイバータイプを紡糸して、これらのタスクを完了する。繊維の種類のそのような専門化は、小さなbiofactoriesとして機能する別のシルク生産腺、の進化を通じて発生しています。これらbiofactoriesの製造と繊維の生産のための絹タンパク質を大量に保管してください。生化学的な一連の複雑なイベントを通じ、これらの絹タンパク質は、押し出し時に固体材料に液体から変換されます。

機械的な研究は、クモの糸は、高張力鋼³より強いことが実証されている。クモの糸糸の構造と機能の関係を理解するために分析は、クモの糸は、主としてそれらのタンパク質配列⁴内のブロックの繰り返しを持つタンパク質、またはフィブロイン、から成ることが明らかになっている。信じられないほどの引張強さとクモの糸の拡張性に貢献する共通の分子の署名は、翻訳絹のcDNAの解析によって解明されています。クモ絹の特別な材料特性を考えると、世界中の研究所では、商業用、軍事および産業用アプリケーションのための合成絹の繊維を製造する紡糸プロセスを理解し、模倣するために争って。研究室で人工的なクモの糸を紡績する主な課題の一つは、シルク生産腺からの繊維の押出し時に発生する生化学的プロセスの完全な理解を伴います。

ここでは、7種類のシルク生産のメジャーとマイナーampullate腺を含むcobweavingクロゴケグモ、から腺を^5,6、小管状の[合成の卵のケースのシルク] [ドラグラインと足場絹を製造している] ⁷の単離のための方法を提示^、8、鞭毛状の[COB -織工の未知の機能]、集計[接着剤の糸を作る]、房状の[合成の獲物のラッピングと卵のケーススレッド] ⁹と梨状¹⁰ [アタッチメントディスクの絹を作り出す]。このアプローチは、二酸化炭素ガス、腹部から頭胸部のその後の分離、およびシルク生産腺を得るために腹部のマイクロダイセクションでクモを麻酔に基づいています。別のシルク生産腺の分離に続いて、これらの組織は、質量分析（MSまたはMS / MS）分析を識別するために、北部、およびウェスタンブロット法、定量的リアルタイムPCRを含む別個の生化学的解析、のために異なる高分子を取得するために使用することができます新しい絹タンパク質配列、絹のアセンブリの経路に関与する、または細胞培養または組織学的実験のために無傷の組織を使用するタンパク質の検索。

プロトコル

1。腹部のスパイダーと分離して麻酔

1. プラスチック（図1A）を敷いた段ボール箱にガラスの瓶から蜘蛛を転送します。我々は一般的にwoodpiles、ガレージや茂みからスパイダーを収集し、ガラス容器の実験室でそれらを収容する。スパイダーは、プラスチックライニングを登っことができないので、麻酔の目的で小さな瓶にガラスの瓶やコーヒーが缶fromスパイダーを転送するために効率的な方法を提供する。この時点でクモを処理する際に、安全のためにラテックス手袋や園芸用手袋の2つのペアを着用してください。
2. クモは、プラスチックと並ぶボックスになっている間は、その裏面からクモに近づくとプラスチック培養瓶にクモのスライドをしましょう​​。スパイダーは、バイアルに入った後、すぐに（図1B）上からプラグインを置きます。我々は、約101.6ミリメートルX 31.75ミリメートル（L x奥行）であるバイアルを使用することをお勧めします。これは、麻酔の手順に必要な炭酸ガスの量を最小限に抑えます。
3. 10分（図1C）のために平方インチあたり5〜10ポンドで炭酸ガスを導入することでクモを麻酔。ガスのこの量は、その麻酔後すぐにステップ1.4から1.5に進む必要があります、約5分間スパイダーをノックアウトされます。
4. 小さな解剖皿に麻酔スパイダーを置き、クモ背側を上（赤い砂時計が下向き）の位置に鉗子を使用する。
5. スパイダー（図1D）の残りの部分から腹部を解放するために（頭胸部と腹部をつなぐ細い茎）小花柄のクリップ。ペトリ皿の中で一晩冷凍庫で頭胸部を格納し、次の日、凍結後に廃棄する。蜘蛛の牙が、このセグメント上に存在するとして、頭胸部を移動する際には注意してください。
6. 単一の昆虫ピンを使用して小さな解剖皿にSylgard材料に腹部を固定します。小花柄のクリッピング（図1E）から作られた穴から昆虫ピンを挿入します。これは簡単に流体が小花柄のクリッピングから浮上しているサイトとして識別することができます。紡糸口金（小花柄の反対側が）（あなたの近くの）底の方を向くことを確認してください。

2。外骨格の除去

1. 小花柄のクリッピングから穴から始まる、microscissorsのペアを使用して外骨格を通して最初の切開を加えます。背側の両側（図1F）に到達するまで横方向にカット。ピンセット、ピールバック前外骨格のセグメントを使用し、この位置に2番目のピンを挿入します。紡糸口金に達するまでつ目のピンの挿入に続いて、（図1G）、最初の横カットから尾側に解剖用トレイ（90 °の角度を）回してカット続けます。この切開は、最初の横カットに垂直または垂直になります。縦切開が行われる紡糸口金（砂時計の後の相対的な、それが円形の外観を持っている）カットスルーしないでください。つ目のピンを挿入する失敗は、縦切開が行われるときに回転腹部になります。
2. 緩衝液（0.1M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、ピロジエチル0.1％）解剖で水没腹部。
3. 最初、横切開から始まる残りの外骨格のバックピール。これが完了すると、脂肪組織では（図1H）はっきりと見えるはずです。

3。絹生産腺の単離

1. 鉗子を使用すると、脂肪層（図1H）を離れていじめ始める。脂肪は黄色がかった外観に白っぽいを持つことになります。脂肪のほとんどが削除され、絹糸腺がはっきりと表示されるまで続けます。小管状の腺は、腹腔内に豊富に存在が非常に長く、円筒管の三対で構成されています。ペアで発見された主要なampullateは、、長い複雑な遠尾と、それはクモの紡糸口金に近づくにつれて幅が減少する近位ダクトを持つ大規模な、三日月型の膨大部です。マイナーampullateは、主要なampullateの形態に非常に似ていますが、それは非常に小型です。また、ペアで発生した鞭毛状の腺は、紡糸口金に向かって伸びる小さな円筒形のジグザグダクト付きラウンドと多小葉のである。集計腺は（ペアで見つかった）その上に大規模な、不規則な葉を持つ、非常に大規模な導管を持つ、非常に大規模な、多小葉の腺です。房状の腺が大量に発生し、短い、小さな指状の突起に似ている。梨状腺は、腹部に小さな腺で、紡糸口金下に拡張する多くの小さな排泄ダクト付きファンに似ている多くの圧縮、円筒状のダクトを持っています。
2. 梨状（図2A - B）その後小管状の、主要なampullate、鞭毛状の、マイナーampullate、集計、房状の、そして：私たちは、次の順序で腺を削除することをお勧めします。
3. 小管状の以降では、番目の残りの部分のこれらの腺を薄くそぐE腺は - 彼らは他の腺（図2A）の上に座ってする必要があります。単一のクモの小管状の腺の3組あります。それらはフリーフロートが、そのダクトが彼らの紡糸口金に添付しておくことができます。
4. 次に、主要なampullate腺を離れていじめる。 one蜘蛛に存在する2つの主要なampullate腺があります。取り外し手順で、ダクトは腺（図2A）に接続されたままにことを確認してください。
5. 、特に骨材および鞭毛状の腺の腺のいずれかに穴を開けることを避けるために慎重に作業し、互いに離れる腺の残りの部分をいじめるし続ける。各腺は、紡糸口金の外骨格にその終了時点までのすべての方法をフローティング自由であるべきです。これらの腺はまたペアで発見されています。鉗子でダクトをつまんで、それが離れて出口ポイントから解除するまで慎重に引いて、各腺を削除します。主要なampullate、鞭毛状の、マイナーampullate、および集約腺はペアで見られる。房状のと梨状腺はより多くのペアで発生する。
6. 鉗子でダクトをつまんで、それが紡糸口金で離れて出口点から故障するまで慎重に引いて、各腺を削除します。我々は一般的にウェット腺を保存しますが、我々は追加のバッファを追加しないでください。
7. 腺が削除されると、滅菌済みの標識を1.5 mlのマイクロ遠心チューブに入れます。個々の腺は、図3A - Gに示されています。氷の上にこれらの腺を維持し、フラッシュは、液体窒素でそれらを凍結。液体窒素で瞬間冷凍に続いて、-80に配置° Cを貯蔵するため。

4。代表的な結果

鞭毛状の、集計腺の処理中にこれらの2つの構造が容易に穿刺し、鉗子で損傷することができるように別の腺を削除する際に、細心の注意は、注意が必要です。さらに、それは形態的に鞭毛状の、集約腺は前の彼らの除去に非常に似ていると彼らはしばしば互いに絡み合っていることは注目に値する。除去時にこれらの組織の交差汚染を防ぐために、解析部は慎重にこれらの構造体を離れていじめるしてください。さらに、絹生産腺の初期の暴露により、房状のと梨状腺は、直ちに、その小さいサイズと解剖学的位置のために視覚化する最も困難になります。しばしば多くの卵の存在がある。この組織は非常に粘着性であり、しばしばあなたの鉗子などが付着するようにまた、追加のケアは、梨状腺を削除するときは注意が必要です。この手順が正しく完了すると、それは高度に精製された方法で単一のクモからすべての7つの絹生産腺を得ることができる。通常の場合、単一のクモの解剖からトータルRNAとタンパク質のマイクログラム量を回復することができます。小管状の制限されたフィブロイン遺伝子、TuSp1、のmRNAレベルを調べるために定量PCRのためのトータルRNAを使用しての例では（図4）示されています。タンパク質溶解物を含む代表的な実験では、腺から収集例えばMSの分析（また、MS / MS分析に使用できる）や、アミノ酸組成分析で、続いて、ソリューショントリプシン消化（それぞれ図5-6、）表示されます。

図1。取り扱い、麻酔、そして女性のクロゴケグモの腹部から外骨格の除去。小さなプラスチック製のバイアル瓶にクモを動かしやすくするためにプラスチックが並ぶ段ボール箱にスパイダーのA）移転。 B）Spiderはプラグのプラスチックバイアル瓶に入れ。 C）炭酸ガスでクモを麻酔。 microscissorsを使用して腹部から頭胸部のD）分離。虫ピンを使用して解剖トレイの腹部のE）固定。横切開ははさみで作られており、外骨格の部分が鉗子でバックpealedされた後、F）の表示。 G）切開は、最初の横カットに対して垂直に作られて。脂肪層の外骨格と露出のH）除去。

図2。クモだけでなく、周囲の組織の腹部の中に無傷の7種類のシルク生産腺の可視化。小管状ののA）画像、主要なampullate、鞭毛状の、12X倍率で集計、マイナーampullate組織。 12Xの倍率で房状のと梨状腺のB）イメージ。

腹部からそれを除去するから七絹生産腺の図3。写真。すべての画像は40Xで行われた房状のと梨状腺、の例外を除いて20倍の倍率で捕獲された。 A）主な腺をampullate、サイズの比較のためにB）のメジャーとマイナーampullate（右側）、C）小管状の、D）鞭毛状の、E）の集約、F）房状の、G）洋梨形。

図4。絹の遺伝子の発現パターンの代表的な結果は、TuSp1、から全RNAの単離後、定量リアルタイムPCR（定量PCR）を使用して別のシルク生産腺（梨状腺を除く）におけるTuSp1 mRNAのレベルを調査した後腺。

図5。トリプシン消化、溶液中で以下の梨状腺から得られたタンパク質抽出物のMS分析の例。注：X2は、スペクトル強度の2倍の倍率を表す。 PySp1フィブロインの領域に対応するスペクトルペプチドイオンの質量は、＃記号で表示されます。

図6小管状の腺から抽出したタンパク質のアミノ酸組成プロファイルの典型的な結果。注：ASX = AspとAsnの、GLX = GluとGlnの。赤い着色が非極性側鎖基を持つアミノ酸残基を表すのに対し、青い着色が極性側鎖基を有するアミノ酸を反映している。

ディスカッション

クロゴケグモから絹糸を生産腺のマイクロダイセクションのための私たちの方法論は、高度に精製されたシルク生産腺を得るために効果的な手段を提供しています。解剖は、7つの別の完全なセットシルク生産cobweaversから腺をもたらして、1.5〜3時間で完了することができます。高度に精製されたシルク腺のサンプルを得ることが選択的に別の腺で発現する遺伝子のmRNAレベルの分析、研究者の...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Electron Microscopy Sciences	SX0420-1	0.1 M in water
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758 - 5 ml	0.1% v/v
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804 - 1 kg	0.015 M in water
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica MZ16
Digital microscope camera	Leica Microsystems	DFC320	Software - Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors	World Precision Instruments, Inc.	500260
Stainless steel forceps	World Precision Instruments, Inc.	501764	Mini Dumont #M5S
Insect pins	Indigo Instruments	33414-2	Insect pins #2
Small or large dissection dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S or DD-90-S	52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm
Drosophila culture vials	Carolina Biological	FR-17-3076	Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm