癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

要約

外因性ヒアルロン酸（HA）と癌細胞の相互作用の高分解能解析を可能にする斬新なアプローチが説明されています。パターニングされた表面は、カルボジイミド化学とマイクロコンタクトプリンティングを組み合わせることによって作製されています。

要約

癌の浸潤や進行は、腫瘍の微小環境内での増殖因子/サイトカインや細胞外マトリックス（ECM）成分による複雑な規制下にある運動性細胞の表現型を伴います。ヒアルロン酸（HA）は、強化の侵入、増殖、および血管新生¹で腫瘍の進行を容易にするために確認されている間質ECMコンポーネントです。その細胞表面の受容体CD44とHAの相互作用は、それによって転移拡散^2-3増加、腫瘍細胞の増殖、生存、および移行を促進するシグナル伝達事象を誘導する。 HAは、D -グルクロン酸とDN -アセチルグルコサミンの繰り返し単位から構成される陰イオン性、nonsulfatedグリコサミノグリカンである。 、二糖繰り返し単位のカルボキシル及びヒドロキシル基の存在のためにネイティブHAの大部分は親水性とphotoreative固定化^4-5硫酸基を導入する化学修飾の影響を受けやすいです。表面にHAの固定化を含むこれまでの研究では^6-7表面上に細胞接着を制御するために、HAのbioresistant挙動とその硫酸化誘導体を利用する。これらの研究では細胞接着には、優先的に非HA模様の領域で発生します。

外因性のHAと細胞間相互作用を分析するために、我々は、制御の研究とHAと癌細胞の相互作用の高解像度可視化を可能にするパターン化された官能化された表面を開発しました。我々は、ガラスの表面にHAの離散パターン領域を定義するためにマイクロコンタクトプリンティング（UCP）を利用。 HAを固定化するカルボジイミドリンク化学を適用する"テザリング"のアプローチは^8を使用しました。ガラスの表面は、マイクロコンタクトをアミノシランで印刷し、パターン化された配列にHA固定化を有効にするEDCとNHSの最適比率のHA溶液と反応させた。 MCPを搭載したカルボジイミド化学を組み込むと、in vitroでのアプリケーションに適したサーフェスを作成、定義された領域にHAの固定化を可能にした。両方の結腸癌細胞および乳癌細胞は、暗黙的にHAマイクロパターン表面と相互作用した。癌細胞の接着は、48時間で増殖して24時間以内に起こった。 HAマイクロパターン表面を使用して、我々は癌細胞の接着は、HA受容体CD44を介して起こることを示した。さらに、HA柄の表面は電子顕微鏡（SEM）と癌細胞の接着剤の突起の許容される高解像度の画像をスキャンし、外因性のHA上で癌細胞の運動性を分析するためにHAパターンで拡散との互換性があった。

プロトコル

1。マイクロパターンスタンプ作製のための標準的なフォトリソグラフィー

1. エタノールで新しいシリコンウエハをリンスし、空気の流れで水分を拭き取ります。ウェハを処理し、全体のプロセスの間に表面欠陥を防止するために鉗子を使用してください。
2. SU - 2025ネガ型フォトレジストを塗布し、カバーウエハの表面を回転させるウエハを転送する。フォトレジストとウェーハの少なくとも80％をカバーしています。 3000rpmの時に30秒間続いて600rpmで10秒間スピンコート、。フォトレジストの感光性のために、前方にこの点から、部屋の照明をオフにしてください。
3. 3分間95℃で"ソフトベーク"のためにホットプレートにコーティングされたシリコンウェハをフォトレジスト転送する。ホットプレートから外し、1分を冷却することができます。
4. フォトレジストで覆われたシリコンウェハの上に所望のパターンを持つプレハブマスクを置き、20秒間紫外線（UV）照射（350〜450 nm）にさらす。
5. 110"ハードベーク"のためのホットプレートに転送シリコンウエハ℃で6分間。
6. ライトの電源を入れ、ホットプレートからウェハを取り外す。明確なパターンは、この時点で表示されるはずです。
7. 慎重にSU - 8フォトレジストの現像液でシリコンウエハをリンス。現像液の3洗浄した後、エタノールですすいでください。いずれかの白い残留物が存在する場合は、フォトレジスト現像液でリンス繰り返す、または単に水没ウエハを現像液で2分間とすすぎエタノールを進めます。水と空気乾燥で洗浄する。
8. 午前10時01分重量比で混合ポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマー溶液と硬化剤。気泡を除去するために5分間900rpmで遠心する。
9. 場所は、ペトリ皿の中でウェーハをパターニングしてシリコンウエハ上にPDMSを注ぐ。泡が消えるまで泡がカップル分間desicatorと真空の場所は、現在がある場合。
10. 補完的なエラストマーのスタンプを形成するために室温（RT）で一晩硬化する。 PDMSは、完全に30分間60℃のオーブンで行われる12時間、後硬化されていない場合。
11. 慎重にシリコンウエハからPDMSを削除します。希望のサイズにスタンプをカットするためにかみそりのエッジを使用してください。 15分間エタノールで超音波洗浄します。ウェーハは、新しいエラストマーのスタンプを作成するために複数回利用することができます。

2。 HAのマイクロパターニング

1. 5分間のプラズマ清浄なガラススライド。 5分間チャンバーと真空中にすべてのスライドを置きます。その後、酸素の低流量でチャンバーを入力することができます。 5分間のプラズマクリーナーを入れます。鉗子を用いてシャーレにプラズマクリーナーと場所から削除します。
2. プラズマ洗浄の間に、15分間エタノールでPDMSスタンプを超音波で分解する。
3. 15 mLの遠心管の95％v / vエタノールで3 - アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS）の新鮮な3パーセントv / v溶液を準備します。シラノールを形成するために室温で5分間反応することができます。
4. パターンアップスピンコーターチャックとカバーの上に置いてPDMSスタンプは、APTMS液で表面をパターン化。 30秒間3500rpmでSpincoat。 PDMSスタンプの唯一の側面は、切手の表面に触れないでください。
5. パターン化された側の一方の端に下向きにセットのスタンプを、それが1分間、ガラス表面に接触して完全になるように静かにPDMSを押すと、GLIDE：プラズマへ転送APTMSソリューションは、ガラス面を掃除した。
6. PDMSは優しくスタンプと削除、およびパターン化されたスライドガラスは、30分間室温でインキュベートすることができます。エタノールと空気乾燥でパターン化表面を洗浄します。過剰APTMSを削除するには、15分間PDMSスタンプを超音波処理してください。
7. 115℃で1時間オーブンでまたはホットプレート上に熱表面℃のエタノールでリンスし、空気で乾燥させます。
8. トルエンの[メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル]トリメトキシシラン - 新鮮なポリエチレングリコール（PEG） - シラン20パーセントV / V 2の溶液を調製します。これは、パターンを囲む非接着領域として機能します。
9. 75℃で45分間、PEG -シラン溶液中でガラスシャーレのインキュベートに転送パターン化されたスライドガラスをホットプレート上に° C。トルエン、水、および空気と乾燥ですすいでください。
10. 生物学的安全キャビネット内の紫外線殺菌照射を使用して1時間滅菌する。無菌性を維持するために前方にこの時点から、生物学的安全キャビネットに進みます。
11. 水性滅菌HAソリューションを準備。
    1 - エチル-3 - （3 - ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）の10mMの
    N -ヒドロキシスクシンイミドの5mMの
    50μg/ mLのフルオレセイン標識HA
12. 無菌状態でパターニングされたガラス基板にHAソリューションを適用し、光から保護。パターニングされた基板は、16〜24時間静にする必要があります。
13. HAソリューションをオフ吸引、で洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水を（PBS）、及び1時間PBSで（BSA）の1％ウシ血清アルブミンとの表面を覆う。表面は細胞培養の準備ができています。

3。 HAマイクロパターン表面上における細胞培養

1. 製造業者の指示に従って、MDA - MB - 231ヒト乳癌細胞とLS174T大腸癌細胞を展開。
2. 0.4 × 10の間に密度のがん細胞のシード単細胞懸濁液2ガラスの表面積当たりとHA固定化表面へ> 6癌細胞。 5％CO ₂で維持雰囲気で加湿インキュベーター（37℃）でインキュベートする。細胞接着は、24時間以内に発生する必要がありますし、倒立光学顕微鏡を用いて観察することができます。
3. 細胞培養表面は、標準的なインキュベータの条件で5日間まで維持することができます。一日おきにメディアを変更します。細胞の形態と成長は、倒立光学顕微鏡を用いて観察することができます。追加の細胞アッセイは、HAの表面への応答を分析するために適用することができます。

4。代表的な結果：

共有結合APTMSパターニングされたガラススライドにHAを固定するために使用されるカルボジイミド化学を図1Aに示されています。 EDCは、アミン反応性中間体を形成するために、HAのカルボキシル基と反応して長さゼロの架橋剤です。この中間体が加水分解を受けやすいとして、NHSは、カルボジイミド反応効率を高めるために追加されます。 HAソリューションはAPTMS微細パターン、HAの中間とATPMSの第一級アミンとの間の安定したアミド結合の形態と相互作用として。 HAパターン表面の例は、HAのパターン化された固定化を示す蛍光顕微鏡とImageJの蛍光強度の解析を用いて可視化（ 図1B - C）が表示されます。

HAマイクロパターン表面はexpgenous HAと癌細胞の相互作用の研究を可能にします。 MDA - MB - 231ヒト乳癌とLS174Tヒト大腸癌細胞株の両方が優先的にHAマイクロパターン領域（ 図2）に従っている。走査型電子顕微鏡を用いた高分解能イメージングは、HA固定化表面（ 図3）による培養細胞の相互作用を分析するために使用することができます。

図1 HAマイクロパターン表面のHA機能面の開発を記述する（）回路図、フルオレセインの（B）蛍光画像（緑）で標識されたHAマイクロパターン化表面。離散的なHAのパターンを示すImageJのソフトウェアを使用して（C）3Dピクセルの分布図。スケールバー=100μmの。エルゼビアから許可を得て^9日から変更。

HAマイクロパターン表面上に図2。癌細胞接着。コロン（）と乳房（B）癌が優先的に文化の24時間とHAのパッチに付着両方。エルゼビアから許可を得て^9日から変更。

HAと図3。癌細胞の相互作用。 （A）大腸癌細胞の低倍率（左）と高倍率（右、左の上の正方形の）に示すように、HAの表面上に（）培養の電子顕微鏡像を走査し、乳癌細胞の（B）に示すように、HA表面上で培養低倍率（左）と高倍率（右、左の上の正方形の）。

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ディスカッション

提示HAの微細方法は、外因性HAと細胞の相互作用の研究が可能になります。 HAは、癌の進行¹に重要な役割を果たすことが知られているしかし、二次元のHAパターニング表面上での癌細胞の相互作用を調査する限られた研究が行われている。外因性HAの微細パターンで制御可能研究は癌細胞の接着、成長、および移行の高解像度可視化を可能にし、癌のさらなる基礎を解明することがで?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SU-2025 photoresist	MicroChem Corp.	Y111069
SU-8 developer	MicroChem Corp.	Y020100
Sylgard 184	Dow Corning
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)	Sigma-Aldrich	281778
2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane)	Gelest Inc.	SIM6492.7
1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	24500
Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA)	Sigma-Aldrich	F1177	Reconstitute with 10ml of DI water
MDA-MB-231 breast carcinoma cells	ATCC	HTB-26
LS174t colon carcinoma cells	ATCC	Cl-188