dsRNAをインジェクションによるRNAiの干渉にショウジョウバエ胚

要約

RNA干渉は、遺伝子の機能を解析することは非常に効果的であることが証明されていますショウジョウバエ気管開発。ノックダウンの遺伝子発現にハエの胚にdsRNAを注入する江研究室で使用されている詳細なプロトコールが示されている。この手法はで組織や臓器の開発に必要なスクリーニングの遺伝子の可能性を秘めているショウジョウバエ。

要約

遺伝学的スクリーニングは、複雑な生物学的プロセス¹への洞察を得るための最も強力な方法の一つである。年間で遺伝子操作のための多くの改良とツールは、 ショウジョウバエ ²で利用可能となっている。すぐに二本鎖RNAをノックダウンするために線虫（Caenorhabditis elegans）における個々の遺伝子の活動を使用することができることFrieとメロ³で最初の発見の後、RNA干渉（RNAi）は、 ショウジョウバエ器官開発における遺伝子機能を解析するための強力な逆遺伝学的なアプローチを提供することが示された^4、5。

肺、腎臓、肝臓、および血管系を含む多くの臓器は、輸送の重要な液体や気体^6、7、その分岐した管状のネットワークで構成されています。 ショウジョウバエ気管形成の分析は、他の管状の臓器⁸の形態形成を研究するための優れたモデルシステムを提供します。バークレーショウジョウバエゲノムプロジェクトでは、気管系で発現される遺伝子の数百を明らかにした。管形成の分子細胞メカニズムを調べるために、課題は、気管の発生におけるこれらの遺伝子の役割を理解することです。ここでは、ノックダウン、個々の遺伝子発現へのショウジョウバエの胚にdsRNAをインジェクションの詳細な方法を説明した。私たちは正常にdsRNAを注射により内因性dysfusion（dys）遺伝子の発現をノックダウン。 Dysは気管融合細胞で発現のbHLH - PASタンパク質であり、そしてそれが気管分岐融合^9、10が必要です。悪RNAiは、完全にdysの発現を排除し、気管の融合の欠陥をもたらした。この比較的単純な方法は、 ショウジョウバエのtissureと臓器の開発のためのrequried遺伝子を同定するためのツールが用意されています。

プロトコル

1。胚のコレクション

1. 25℃ケージをセットアップ° 2から4日齢のワット¹¹¹⁸ flies.Grapeジュースプレートを使用してCは、コレクションの前に1〜2日間にわたって卵のコレクションの同期をとるために日中時間ごとに変更されています
2. 25℃で1時間のために胚を集める° C
3. かみそりの刃を途中で軽くカットグレープジュース寒天の長方形の部分を、カット、寒天に線を残す
4. グレープジュース寒天のあなたの部分にブドウジュースのプレートから胚を転送するために金属製のプローブを使用して、寒天の真ん中の線に対して45度の角度で、胚の長軸と直線でそれらを並べる。約50胚の直線を取得します。ラインからポインティング後端と、すべての胚のポイント同じ方向を確認してください。
5. ダブルスティックテープの長方形の部分をカットし、18x18mmのカバースリップに置きます。
6. カバースリップ上でダブルスティックテープで胚を拾う
7. ガラスのスライドにカバースリップを置き、約10分間空気中で胚を乾燥させる。
8. 700ハロカーボンのオイルの薄い層で胚をカバーする、今では注射の準備ができています。

2。ニードルを引いて

ガラスキャピラリーチューブを引いて、マイクロインジェクションの針を作る。我々は、世界の精密機器（モデルPUL - 1）からニードルプラーを使用。針の引き手のプログラムの仕様は以下のとおりです。熱：1、ディレイ4。

3。針を充填

エッペンドルフMicroloaderチップを搭載したエッペンドルフP20のピペットを使用して、バックロードの針は、通常、1.5〜2μLdsRNAをロードする

4。針を破る

1. 針を壊す前に、スライドにカバースリップを配置。
2. スライドの真ん中にオイルのドロップでスライドを準備する
3. エア圧を調整するPicospritzer III picopumpをオンに
4. 鋭いポイントを作成し、カバースリップの端に満たされた注射針を破る。
5. 先端が切断されると、Picospritzer III picopumpのフットペダルでのステップは、いくつかのdsRNAは、針の先端部から外れリークが発生します。
6. カバーグラスとスライドを取り出してください。
7. 前準備、スライドの中央にある油滴の下に針を挿入します。
8. あなたがフットペダルを踏む時に100 200pl dsRNAを得るためにPicospritzer III picopumpに設定を調整します。 dsRNAは、小さな液滴として見ることができます。

5。注射

1. 同じ焦点面への最初の胚盤葉の胚の後方部分に針の先端を持参し、30〜50％、卵の長さの周りに中心から離れた位置に胚を注入する。
2. あなたがPicospritzer III picopumpのフットペダルを踏むの後、dsRNAの少量の注射部位に小さなドットとして表示されます。

6。表現型分析

1. 胚は、目的の胚の段階に発展するまで注入した後、18日にカバー湿室（プラスチックシャーレ）° Cにスライドを配置する。
2. 両面テープから胚を除去し、カバースリップの端にそれらをプッシュするプローブを使用してください。
   ヘプタンを用いて下部のナイロンメッシュ付きコレクションバイアルにスライドから胚を洗浄、PBTで3回洗浄する。
   Dechorionate 5分間50％の漂白剤の胚、とはPBTで3回洗浄する。
   コレクションバイアルからナイロンメッシュの部分に胚を転送し、胚を解放するために固定溶液（5ミリリットルヘプタン、4.5ミリリットルPBS、0.5ミリリットルの37％ホルムアルデヒド）にナイロンメッシュを浸し。 30分のための固定液に胚を修正。
   エッペンドルフチュー​​ブに胚を転送し、標準プロトコルを使用して胚を免疫染色、メタノールで胚をDevitellinize。
3. 胚はまた、適切な幼虫期に開発することができます。
4. 真ん中のハロカーボン700オイルのドロップでスライドを準備する
5. スライド一つ幼虫を転送する、上にカバースリップを入れて
6. 明視野顕微鏡下で幼虫を観察。

7。代表的な結果：

dsRNAの例では、Fig1に示されているDrosophlia胚におけるdysfusion（dys）遺伝子をノックダウン。 GFP - dsRNAを注入胚ではネガティブコントロールです。 Dysは気管融合細胞で発現のbHLH PAS転写因子である。 GFP - dsRNAを注入された胚は、通常の気管の融合を示し、Dysタンパク質は、融合細胞（図1A）に存在しています。一方、悪dsRNAを注入された胚は、障害が発生した分岐の融合を示し、Dysタンパク質融合細胞（図1B）には存在しません。 dsRNAが胚は幼虫期に開発注入すると、悪dsRNAを注入された幼虫は、GFP - dsRNAを注入したネガティブコントロール（図1C）と比較して失敗した分岐の融合（Fig.1D）を示した。これらの結果は、 ショウジョウバエの胚にdsRNAを注入することにより内因性のdysの遺伝子の発現のノックダウン効果を示した

図1。悪RNAiによるdys機能の除去は、気管融合dを明らかにefects。胚盤葉の胚^（1118 W）はGFP - dsRNAが（ネガティブコントロール）または悪dsRNAをどちらかを注入し、気管の欠陥を測定した。 （A）ステージ16胚では、GFP - dsRNAを注射し、α- DysおよびMAb 2A12その汚れは、気管内腔で染色。目立つように融合している横方向のトランクは、示されている。矢印は横トランク悪正の融合細胞を指す。 （B）ステージ16胚では、悪dsRNAを注射し、α- DysおよびMAb 2A12で染色。胚は、横方向のトランクの融合（アスタリスクは対照胚における横幹の融合の正常な位置を示す）の欠如を示した。いいえ悪陽性細胞が悪RNAが効率的にDysのタンパク質を廃止したことを示す、観察されなかった。 GFP - dsRNA又は悪dsRNAをどちらかを含む第2齢幼虫（DのC）は気管の欠陥のための明視野顕微鏡で観察した。 （C）融合のサイトは、GFP - dsRNAを注入制御の幼虫のアスタリスクによって示されます。 （D）横方向のトランクが悪RNA注入幼虫の融合に失敗した、（*）は、横方向のトランクの融合の正常な位置を示している。

ディスカッション

dsRNAの注入法の存在はここにショウジョウバエ気管開発における遺伝子機能の非常に敏感かつ迅速な分析が可能になります。このメソッドは、潜在的に他の組織や臓器の開発のための遺伝子機能の解析に適用することができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Picospritzer III picopump	Parker Hannifin Corporation	051-0500-900
Micro-pipettes	Fisher Scientific	21170M
Microloaders	Eppendorf	930001007